[發明專利]一種優化的臨床用TCM分選、誘導培養和質量控制鑒定試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201811194036.2
• 申請日: 2018-10-15
• 公開（公告）號: CN109266607A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 路春光
• 申請（專利權）人: 路春光
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12Q1/02;A61K35/17;A61P35/00;A61P31/12;A61P31/06;A61P31/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及免疫細胞靶向治療技術領域，特別涉及一種優化的從人體外周血或外周血單個核細胞中分離純化記憶性免疫細胞（TCM）或CD8T+細胞試劑盒，TCM誘導擴增試劑盒及產品質量控制鑒定的試劑盒體系和應用。在臨床應用中，TCM細胞培養過程中采用的試劑較多，標準不一致，培養過程中工作量大，培養時間長，工藝繁瑣，不穩定，染菌風險大，細胞質量標準難以控制，許多技術人員很難在短時間內培養出質量均一的TCM細胞，迫切需要開發簡單、格式化的試劑盒，同時本發明通過進一步優化誘導因子組合物TCM?III，節省了原材料，降低了生產成本；誘導培養前用TCM?II包被培養板TCM細胞增殖倍數提高了2?3倍，凋亡指數降低，活性提高了10%?20%，有效細胞的絕對數量提高了2?3倍；TCR基因轉染前，用TCM?II包被培養板可提高轉染效率。本發明改進了工藝，這對臨床上提高腫瘤治療療效，清除殘留病灶，防止腫瘤的復發和轉移具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及免疫細胞靶向治療技術領域，特別涉及一種優化的從人體外周血或外周血單個核細胞中分離純化記憶性免疫細胞（TCM）或CD8T+細胞試劑盒，TCM誘導擴增試劑盒及產品質量控制鑒定的試劑盒體系和應用。

背景技術

過繼性細胞治療技術為打破腫瘤患者中樞和外周免疫耐受，恢復或增強其抗腫瘤免疫功能提供了一種有效的方法。然而目前還存在不少問題亟待解決，包括：1)如何獲得充分數量的腫瘤反應性T細胞是決定過繼性細胞治療效果的最關鍵因素；2)目前回輸的免疫細胞尤其是克隆化CD8+T細胞在體內難以長期存活，極大的影響了過繼性細胞治療的臨床療效。

記憶性T細胞在體內再次遭遇相同抗原時可迅速活化發揮免疫效應，同時具有自我更新能力，能夠提供更為長期的免疫保護，可能為過繼性細胞治療提供更為合適的免疫效應細胞。有望在回輸體內后建立更長期的抗腫瘤免疫。分離記憶性T細胞并通過TCR基因轉染有望提供具有更強生存能力和效應功能的腫瘤反應性T細胞。

本發明人2017年發明了《外周血單個核細胞誘導的記憶性免疫細胞及應用》（專利號：201710712565.6），在臨床應用中，TCM細胞培養過程中采用的試劑較多，標準不一致，培養過程中工作量大，培養時間長，工藝繁瑣，不穩定，染菌風險大，細胞質量標準難以控制，許多技術人員很難在短時間內培養出質量均一的TCM細胞，迫切需要開發簡單、格式化的試劑盒，同時本發明通過進一步優化誘導因子組合物TCM-III，節省了原材料，降低了生產成本；誘導培養前用TCM-II包被培養板TCM細胞增殖倍數提高了2-3倍，凋亡指數降低，活性提高了10%-20%，有效細胞的絕對數量提高了2-3倍；TCR基因轉染前，用TCM-II包被培養板可提高轉染效率。本發明改進了工藝，這對臨床上提高腫瘤治療療效，清除殘留病灶，防止腫瘤的復發和轉移具有重要的意義。

發明內容

為了解決過繼性細胞治療技術中免疫細胞在體內難以長期存活，缺少靶向性的問題；本申請提供了一種從人體外周血或低溫凍存的外周血單個核細胞（PBMC）中分離純化記憶性T細胞（TCM）或CD8T+細胞，TCM誘導活化率高的試劑盒及應用，然后將腫瘤特異或病毒特異性TCR基因轉染自體TCM，使免疫細胞治療具有長效性和靶向性。

本發明是通過以下步驟得到的：

1.TCM或CD8T+細胞的分選、刺激與基因轉染

（1）本發明提供一種人體外周血TCM或CD8T+細胞分選試劑盒以及產品鑒定試劑盒。

(2) 所述人體TCM或CD8T+細胞分選試劑盒包括，CD8重力柱，Reagent1：CD8純化試劑，由CD8Fab-Strep和Buffer CI構成。Reagent2：CD62L+純化試劑，由CD62L+Fab-Strep和Buffer IS構成。Reagent3：CD45RA-純化試劑，由CD45RA-Fab-Strep和Buffer IS構成。Reagent4：Strep-Tactin Magnetic Microbeads.Reagent5：洗脫液，由D-biotin和BufferIS構成。