[發(fā)明專利]一種檢測煙葉中青枯病菌的時(shí)間分辨熒光定量試紙條及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811193686.5
• 申請(qǐng)日: 2018-10-15
• 公開（公告）號(hào): CN109406778B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范子彥;胡利偉;鄧惠敏;張艷玲;李中皓;牟文君;楊飛;郭建華;劉珊珊;薛超群;邊照陽;戴華鑫;唐綱嶺;宋紀(jì)真;王穎;尹啟生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心;中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/533;G01N33/543
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

本發(fā)明涉及煙草中青枯病菌的檢測，具體是一種檢測煙葉中青枯病菌的時(shí)間分辨熒光定量試紙條及其制備方法和應(yīng)用。該試紙條構(gòu)成依次包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和底板；其特征在于：所述的結(jié)合物釋放墊上噴涂有時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記的檢測抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有捕獲抗體的檢測線和羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；本發(fā)明以時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記檢測抗體，采用免疫層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)煙葉中青枯病菌的快速免疫分析。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測煙葉中青枯病菌含量的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可準(zhǔn)確定量，檢測快速、操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大批量的煙葉樣品進(jìn)行快速檢測和現(xiàn)場檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及煙葉中青枯病菌的檢測，具體是一種利用時(shí)間分辨熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測煙葉中青枯病菌含量的試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

煙草青枯病又稱“煙瘟”，是由青枯假單孢桿菌引起的一種重要的維管束病害，近年來在我國主要產(chǎn)煙區(qū)呈加重發(fā)生趨勢(shì)，對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量造成無法挽回的巨大損失，是制約我國煙草生產(chǎn)最具威脅的病害之一。

目前青枯病菌的檢測方法主要有常規(guī)檢測法，血清學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），分子生物學(xué)檢測方法如核酸分子雜交、PCR擴(kuò)增，膠體金法等。常規(guī)測定法的優(yōu)點(diǎn)在于簡便易行，其缺點(diǎn)是檢測周期長初學(xué)者誤判率高，難以達(dá)到“快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)”的要求；分子生物學(xué)檢測方法比如定量PCR檢測能夠準(zhǔn)確獲得煙葉中青枯病的數(shù)量，但是過程較為復(fù)雜，技術(shù)難度高，對(duì)操作者要求比較高；膠體金法能對(duì)煙草中青枯病菌進(jìn)行定性分析，操作簡單，檢測時(shí)間較短，但檢測靈敏度低，人為因素干擾較大。

綜上，在生產(chǎn)中有必要建立簡便有效、操作性強(qiáng)的煙草青枯病早期檢測方法，以滿足基層技術(shù)人員及田間工作實(shí)際需要，為煙草青枯病防治工作提供準(zhǔn)確及時(shí)的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)難題而開發(fā)了一種適用于煙葉中青枯病菌定量檢測的一種免疫層析試紙條以及檢測方法，該方法具有靈敏度高，操作簡單快捷，成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于煙葉中青枯病菌的快速檢測。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種檢測煙葉中青枯病菌的時(shí)間分辨熒光定量試紙條，包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和底板；其特征在于：所述的結(jié)合物釋放墊上噴涂有時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記的青枯病菌檢測抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有青枯病菌捕獲抗體的檢測線和羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；所述青枯病菌捕獲抗體及青枯病菌檢測抗體是由青枯病菌或青枯病菌外泌蛋白為免疫原制備獲得具有不同表位的單克隆抗體。

所述時(shí)間分辨熒光微球是直徑為100 nm~500 nm的稀土離子作為標(biāo)記物的熒光微球，其表面修飾有合適密度的羧基或其他功能基團(tuán)，用于蛋白、抗體和核酸的共價(jià)偶聯(lián)。

所述青枯病菌外泌蛋白是通過構(gòu)建質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)、純化制備獲得

制備青枯病抗體的免疫原為青枯病菌時(shí)，是指青枯病亞洲分支（演化型Ⅰ）序列變種13、15、17和34，是通過平板培養(yǎng)純化所得。

制備青枯病抗體的免疫原為外泌蛋白時(shí)，是指多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶、果膠酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶、鞭毛蛋白，是通過構(gòu)建質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)、純化制備獲得。

一種制備上述試紙條的方法，包括以下步驟：

1）制備噴涂有青枯病菌檢測抗體-熒光微球標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊：用熒光微球標(biāo)記檢測抗體，并將其噴涂在結(jié)合物釋放墊上。

2）制備包被有青枯病菌捕獲抗體的檢測線和包被有羊抗鼠二抗的質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；即將捕獲抗體和羊抗鼠二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測線和質(zhì)控線；