[發明專利]一種檢測煙葉中青枯病菌的時間分辨熒光定量試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811193686.5
• 申請日: 2018-10-15
• 公開（公告）號: CN109406778B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 范子彥;胡利偉;鄧惠敏;張艷玲;李中皓;牟文君;楊飛;郭建華;劉珊珊;薛超群;邊照陽;戴華鑫;唐綱嶺;宋紀真;王穎;尹啟生
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心;中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/533;G01N33/543
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種檢測煙葉中青枯病菌的時間分辨熒光定量試紙條，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和底板；其特征在于：所述的結合物釋放墊上噴涂有時間分辨熒光微球標記的青枯病菌檢測抗體；所述的硝酸纖維素膜上包被有青枯病菌捕獲抗體的檢測線和羊抗鼠二抗的質控線；所述青枯病菌捕獲抗體及青枯病菌檢測抗體是由青枯病菌或青枯病菌外泌蛋白為免疫原制備獲得具有不同表位的單克隆抗體；

所述青枯病菌外泌蛋白是通過構建質粒，利用大腸桿菌表達體系表達、純化制備獲得；

制備青枯病抗體的免疫原為青枯病菌時，是指青枯病亞洲分支序列變種13、15、17和34，是通過平板培養純化所得；

所述青枯病菌外泌蛋白是指多聚半乳糖醛酸內切酶、果膠酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶。

2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于：所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼在底板上，且結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。

3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于：所述時間分辨熒光微球是直徑為100 nm~500 nm的稀土離子作為標記物的熒光微球，其表面修飾有合適密度的羧基或其他功能基團，用于蛋白、抗體和核酸的共價偶聯。

4.一種制備權利要求1-3任一項所述試紙條的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）制備噴涂有青枯病菌檢測抗體-熒光微球標記物的結合物釋放墊；

2）制備包被有青枯病菌捕獲抗體的檢測線和包被有羊抗鼠二抗的質控線的硝酸纖維素膜；

3）將1）和2）制備好的結合物釋放墊、硝酸纖維素膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。

5.根據權利要求4所述的試紙條的方法，其特征在于，在步驟1）中，在噴涂青枯病菌檢測抗體-熒光微球標記物之前，結合物釋放墊用含0.2~1w/w%牛血清白蛋白、pH 7.4的0.02~0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液浸泡2 h，37℃下烘干2 h，該Tris-HCl緩沖液含0.1~5 %的海藻糖和0.02~0.1% Tween-20。

6.一種應用權利要求1-3任一項所述試紙條檢測煙葉中青枯病菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1）對煙葉進行前處理；

2）用權利要求1-3任一項所述的試紙條進行檢測，可給出煙葉中青枯病菌的準確定量結果；

3）分析檢測結果：定量試紙條硝酸纖維素膜上熒光信號可被免疫熒光分析儀快速讀取；

4）免疫熒光分析儀可準確讀取365 nm激發、610 nm發射的熒光信號，具體形式分為臺式檢測和手持式檢測。