[發(fā)明專利]基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)布魯氏菌感染的體系

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811191942.7
• 申請(qǐng)日: 2018-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN109402229A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳國(guó)球;舒建洪;呂正兵;何玉龍;童夏霞;楊芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州洪晟生物技術(shù)股份有限公司;杭州洪橋中科基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 上海諾衣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31298
• 代理人: 衣然

本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)布魯氏菌感染的體系、試劑盒及檢測(cè)方法。該檢測(cè)體系、試劑盒和檢測(cè)方法包括擴(kuò)增引物系統(tǒng)和分子信標(biāo)探針系統(tǒng)，所述擴(kuò)增引物系統(tǒng)包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物對(duì)，所述分子信標(biāo)探針系統(tǒng)包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。與細(xì)菌培養(yǎng)、SAT和RBPT等血清學(xué)試驗(yàn)相比，能夠提高檢測(cè)效率，并且特異性好、靈敏度高，具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)布魯氏菌感染的體系、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病，導(dǎo)致動(dòng)物的繁殖障礙和人類的發(fā)熱性疾病，并且在中東、西亞、非洲和南美等地區(qū)流行。在過去的幾十年中，中國(guó)特別是新疆和內(nèi)蒙古的人類布魯氏菌病患病率顯著增加?；谑褂靡幌盗屑?xì)菌學(xué)和生物化學(xué)測(cè)試的單一表型特征，布魯氏菌通常分為六種。近年來，由于從海洋哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和感染的人類乳房植入物中分離出幾種新的布魯氏菌菌株，物種數(shù)量已增加到10。

人體中的布魯氏菌病具有多種臨床癥狀，其中最重要的是斷續(xù)不穩(wěn)定的發(fā)熱和動(dòng)脈痛。大部分患者伴有脾腫大和/或肝腫大。當(dāng)疾病變?yōu)槁詴r(shí)，它會(huì)影響幾乎所有器官并導(dǎo)致復(fù)雜的綜合征，包括脊椎炎、心內(nèi)膜炎和腦膜腦炎等。

一般來說，布魯氏菌病的診斷方法包括直接微生物分析和間接檢測(cè)，如血清學(xué)檢測(cè)。細(xì)菌培養(yǎng)是疾病決定性診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)，但需要較長(zhǎng)時(shí)間，靈敏度較低。血清學(xué)檢測(cè)方法如標(biāo)準(zhǔn)凝集試驗(yàn)（SAT）和板式孟加拉紅平板凝集實(shí)驗(yàn)（RBPT）均為用于檢測(cè)抗布魯氏菌抗體，但血清學(xué)方法可能被疫苗，反復(fù)暴露于抗原刺激，或與布魯氏菌以外的抗原交叉反應(yīng)等問題混淆，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

與細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，分子測(cè)定法是度敏度高的，并且與血清學(xué)方法相比更具特異性。PCR方法具有可信度高，成本效益高，靈敏度高，特異高并且檢測(cè)快速，越來越多地被用作鑒定布魯氏菌屬、種和生物型的特定序列，以及利用它作為減少布魯氏菌病爆發(fā)的監(jiān)測(cè)工具。

分子信標(biāo)（MB）是標(biāo)記的單鏈寡核苷酸，具有莖 - 環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)是與其靶序列互補(bǔ)的單菌株，而莖是由5至7bp的兩個(gè)抗互補(bǔ)臂形成的雙菌株以穩(wěn)定環(huán)。一條臂的末端用熒光團(tuán)標(biāo)記，另一條臂的末端用淬滅基團(tuán)連接。環(huán)與其靶序列的結(jié)合打開了莖并從熒光團(tuán)中除去了淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生了熒光。MB生成信號(hào)僅在目標(biāo)存在的情況下產(chǎn)生。為了克服檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的誤導(dǎo)，需要一種診斷布魯氏菌感染的新方法。 在本研究中，建立并評(píng)估了基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR方法。通過與細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)試驗(yàn)比較來評(píng)估了其診斷價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明提供一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)布魯氏菌感染的體系、試劑盒及檢測(cè)方法，能夠提高檢測(cè)效率，并且特異性好、靈敏度高。

一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)布魯氏菌感染的體系，其特征在于，包括擴(kuò)增引物系統(tǒng)和分子信標(biāo)探針系統(tǒng)，其中，所述擴(kuò)增引物系統(tǒng)包括序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物對(duì)。

在一些實(shí)施例中，所述分子信標(biāo)探針系統(tǒng)包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。