[發(fā)明專利]基于分子信標(biāo)的實(shí)時定量PCR檢測布魯氏菌感染的體系

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811191942.7
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109402229A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳國球;舒建洪;呂正兵;何玉龍;童夏霞;楊芳
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州洪晟生物技術(shù)股份有限公司;杭州洪橋中科基因技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 上海諾衣知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31298
• 代理人: 衣然

1.一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時定量PCR檢測布魯氏菌感染的體系，其特征在于，包括擴(kuò)增引物系統(tǒng)和分子信標(biāo)探針系統(tǒng)，其中，所述擴(kuò)增引物系統(tǒng)包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物對。

2.如權(quán)利要求1所述的體系，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針系統(tǒng)包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。

3.如權(quán)利要求2所述的體系，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針系統(tǒng)還包括用熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記SEQ ID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端；

優(yōu)選的，所述熒光團(tuán)選自熒光素亞酰胺（FAM）、6-羧基熒光素、六氯- 6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、 磺酰羅丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一種；

優(yōu)選的，所述淬滅基團(tuán)選自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和DHQ-3中的一種；

優(yōu)選的，所述熒光團(tuán)選自熒光素亞酰胺（FAM），所述淬滅基團(tuán)選自DABCYL，分別標(biāo)記SEQID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端。

4.一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時定量PCR檢測布魯氏菌感染的試劑盒，包括上述任一權(quán)利要求所述的體系。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述基于分子信標(biāo)的實(shí)時定量PCR檢測布魯氏菌感染的試劑盒還包括DNA提取試劑、PCR反應(yīng)緩沖液、Mg²⁺試劑、dNTPs、DNA Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、無菌水(ddH₂O)中的至少一種。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對的使用濃度為10~100 pmol/L；優(yōu)選50 pmol/L；

所述分子信標(biāo)探針的使用濃度為20~100 pmol/L；優(yōu)選50 pmol/L；

所述PCR反應(yīng)緩沖液的成分包括KCl、Tris-HCl、1％TritonX-100，10×的PCR反應(yīng)緩沖液的使用濃度為0.1~4.5 mmol/L；優(yōu)選1.2 mmol/L，所述Mg²⁺試劑如MgCl₂試劑等，Mg²⁺的使用濃度為0.2~5 mmol/L；優(yōu)選2.0 mmol/L；所述dNTPs中各dNTP的使用濃度為0.1~5 mmol/L；優(yōu)選1.0 mmol/L；所述DNA Taq聚合酶的使用濃度為0.5單位。

7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還可含有陽性對照；優(yōu)選，所述陽性對照為含有布魯氏菌陽性對照質(zhì)粒的溶液；

所述試劑盒中還可含有陰性對照；優(yōu)選，陰性對照為各種不含有布魯氏菌的溶液；再優(yōu)選，陰性對照為PCR反應(yīng)緩沖液、無菌水(ddH₂O)、生理鹽水或含有非相關(guān)病原體對照質(zhì)粒的溶液。

8.一種基于分子信標(biāo)的實(shí)時定量PCR檢測布魯氏菌感染的檢測方法，包括如下步驟：

提取待測樣本的DNA；

以提取的DNA作為模板，以所述擴(kuò)增引物系統(tǒng)作為擴(kuò)增引物，并加入分子信標(biāo)探針系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增；

在實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增過程中檢測熒光信號，得到檢測結(jié)果。

9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增條件設(shè)置為：在95℃變性5分鐘，在95℃條件下變性30秒，在55~65℃條件下退火30秒，在72℃下擴(kuò)增30秒，PCR循環(huán)20~50次；

所述檢測熒光信號的溫度在30~50℃，優(yōu)選在45℃下檢測熒光信號。

10.如權(quán)利要求1-3任一所述的體系、權(quán)利要求4-7任一所述的試劑盒和權(quán)利要求8-9任一所述的檢測方法在制備布魯氏菌檢測產(chǎn)品中的用途。