[發(fā)明專利]一種眼袋脂肪干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法

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• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109266605A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 費(fèi)方利;王浩
• 申請（專利權(quán)）人: 希瑞干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32260
• 代理人: 張歡勇

一種眼袋脂肪干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟：脂肪組織的獲取、脂肪干細(xì)胞的分離、脂肪干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明中的一種脂肪干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、細(xì)胞采用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，無異源血清成分加入，減少對細(xì)胞的傷害和后期臨床使用時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)；2、細(xì)胞狀態(tài)良好，活力佳，細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、表面標(biāo)記物表達(dá)以及分化能力好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種眼袋脂肪干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成人干細(xì)胞具有多向分化潛能的熱點(diǎn)細(xì)胞，是一種大多數(shù)成人器官中發(fā)現(xiàn)的具有骨形成能力和造血功能的細(xì)胞群體，可以從骨髓、臍血、脂肪中提取，在特定的培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞是目前組織工程的主要種子細(xì)胞。經(jīng)歷了多年多學(xué)者的研究后，雖然組織工程已經(jīng)獲得了很大進(jìn)展，然而，由于目前缺乏理想篩選方法，間充質(zhì)干細(xì)胞不易獲取、體外擴(kuò)增困難等限制，使其在臨床級別回輸?shù)膽?yīng)用受到限制。因此，尋找一種易于獲得、免疫原性低、易于體外擴(kuò)增的臨床治療級別的種子細(xì)胞是目前組織工程迫切需要解決的問題之一。

人們已經(jīng)從脂肪組織分離出一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)特殊體系中成功地分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與肌細(xì)胞等，這種可分化的干細(xì)胞被認(rèn)可為脂肪來源的間充質(zhì)細(xì)胞，即脂肪干細(xì)胞或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)，是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞具有分化多胚層全能性特征，其中包括中胚層，內(nèi)胚層和外胚層分化細(xì)胞的能力，能分泌許多潛在的有利的細(xì)胞因子，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方法快速發(fā)展。脂肪源性干細(xì)胞是一群多功能間充質(zhì)干細(xì)胞，可以分化為其他的細(xì)胞系在脂肪組織的非脂肪(間質(zhì))碎片中存在大量的脂肪源性細(xì)胞，且易于分離獲取。

脂肪干細(xì)胞自2001年被發(fā)現(xiàn)之后收到很大的重視。經(jīng)過研究表明，脂肪干細(xì)胞具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多向分化潛能。2012年1月，韓國FDA批準(zhǔn)的自體脂肪干細(xì)胞藥物Cuepistem成功上市，用于治療復(fù)雜性克隆氏病并發(fā)肛瘺。同年10月，美國FDA批準(zhǔn)了Cytori Therapeutics公司脂肪干細(xì)胞對心臟衰竭患者有效性的臨床試驗(yàn)。脂肪干細(xì)胞不僅具有各類干細(xì)胞具有的優(yōu)勢，還具有取材方便、創(chuàng)傷小、來源充足，一次可以獲得大量新鮮的干細(xì)胞，自體使用沒有免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，而且避開了胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)困擾和骨髓干細(xì)胞的來源稀缺等麻煩。因此脂肪干細(xì)胞具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前脂肪干細(xì)胞的分離方法多采用機(jī)械法處理之后，利用酶消化的方法進(jìn)行分離，操作步驟繁瑣，分離效率低，在后期的培養(yǎng)中多添加雙抗和血清，雖然對培養(yǎng)有一定的好處，也增加對細(xì)胞的傷害和后期臨床使用時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種眼袋脂肪干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法，目的在于克服目前脂肪干細(xì)胞分離提取技術(shù)的不足，而提供的一種眼袋脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其具有操作簡便、分離效率高、細(xì)胞增殖速度快的特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊，可為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供大量種子細(xì)胞。

本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

本發(fā)明為一種眼袋脂肪干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法，包括如下步驟：

1)眼袋脂肪組織的獲取：眼袋脂肪組織為醫(yī)院在無菌條件下通過老年人眼袋手術(shù)取下的脂肪廢棄物，置于無菌生理鹽水中以2-8℃保存，儲存時(shí)間不超過24小時(shí)；