[發明專利]一種眼袋脂肪干細胞分離及體外培養的方法

在審

• 申請號: 201811189419.0
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109266605A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 費方利;王浩
• 申請（專利權）人: 希瑞干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 張歡勇

1.一種眼袋脂肪干細胞分離及體外培養的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)眼袋脂肪組織為醫院在無菌條件下通過老年人眼袋手術取下的脂肪廢棄物，置于無菌生理鹽水中以2-8℃保存，儲存時間不超過24小時；

(2)將眼袋脂肪組織用清洗液沖洗3-5遍，用無菌手術剪及鑷子去除脂肪樣本中的血絲，并將脂肪樣本剪成1mm³大小的組織塊，放入50mL離心管中，體積為0.5-3mL；加入消化酶，消化酶與脂肪組織的比例為5:1-1.5:1，37℃恒溫搖床震蕩消化40-60分鐘，消化結束后，消化液經70μm濾網過濾，將濾液移入50ml離心管，1500rpm離心10分鐘，移除上層黃色油脂和中間層消化液，收集沉淀并加入生理鹽水沖洗1-2次，1500rpm離心6分鐘，收集沉淀，即為眼袋脂肪干細胞；

(3)眼袋脂肪干細胞沉淀中加入2ml無血清培養基重懸，按照10000-20000/cm²密度接種于6孔板或培養皿，于37℃，5％二氧化碳培養箱進行孵育，接種3-5天后更換新的無血清培養基，之后每隔2-4天進行一次無血清培養基的換液，至細胞融合率達到70％-80％；對眼袋脂肪干細胞進行傳代，方法為棄去原培養基，用清洗液清洗細胞1-2次，加入重組胰酶，在37℃條件下消化1-2分鐘，加入培養基終止消化反應，將細胞懸液轉移至50mL離心管中，再用清洗液清洗6孔板或者培養皿，將清洗液也轉移至50ml離心管中，1500rpm離心6分鐘，收集細胞沉淀，以細胞密度為10000-20000/cm²接種至培養瓶，于37℃，5％二氧化碳培養箱進行孵育；重復上述步驟至傳代到P2-P4代，用細胞計數儀進行臺盼藍染色計數，以細胞密度1-5*10e6/mL凍存細胞。

2.根據權利要求1所述的一種眼袋脂肪干細胞分離及體外培養的方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中所述清洗液由生理鹽水與雙抗按照體積比500:5混合制成。

3.根據權利要求1所述的一種眼袋脂肪干細胞分離及體外培養的方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中所述消化酶由0.1％Ⅰ型膠原酶、0.05％IV型膠原酶、0.25％胰酶/EDTA按體積比1.5-3:1.5-3:1混合制成。

4.根據權利要求1所述的一種眼袋脂肪干細胞分離及體外培養的方法，其特征在于，步驟(3)中所述無血清培養基由Lonza無血清培養基、PALL血清替代物、20mmol/L L-谷氨酰胺溶液按照體積比500:10:5混合制成。