[發(fā)明專利]一種包含E4BP4基因的慢病毒重組載體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811188982.6
• 申請(qǐng)日: 2018-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN109266683B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸前進(jìn);王子君;趙明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P37/02
• 代理公司: 北京中和立達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11756
• 代理人: 祝妍

本發(fā)明提供了包含E4BP4基因的慢病毒重組載體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，所述包含E4BP4基因的慢病毒重組載體包括E4BP4基因和GV358慢病毒載體；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述包含E4BP4基因的慢病毒重組載體可以用于抑制TFH細(xì)胞的活化和分化，為臨床上活化TFH細(xì)胞增強(qiáng)免疫治療的效果提供了一種新的方便可控的思路，對(duì)比與傳統(tǒng)的藥物的抑制TFH細(xì)胞活化分化，本發(fā)明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重組載體更加快捷，可逆。另外，本發(fā)明提供的包含E4BP4基因的慢病毒重組載體安全無(wú)毒，且具備治療活性，能夠滿足臨床需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種包含E4BP4基因的慢病毒重組載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期的表達(dá)且安全性高。該慢病毒為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。

濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞(Tfh)是主要負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的CD4⁺T細(xì)胞亞群，其定位于淋巴濾泡，免疫表型為CXCR5⁺PD-1⁺CD4⁺。轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6決定CD4⁺T細(xì)胞分化為Tfh細(xì)胞。IL-21是Tfh細(xì)胞執(zhí)行效應(yīng)功能的主要細(xì)胞因子。研究表明，Tfh細(xì)胞的異常表達(dá)與自身免疫性疾病密切相關(guān)，但Tfh細(xì)胞在疾病中的作用機(jī)制尚不明確，通過(guò)抑制Tfh細(xì)胞的異常表達(dá)以及阻斷其效應(yīng)分子能否治療自身免疫性疾病有待進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種包含E4BP4基因的慢病毒重組載體及其制備方法以及所述慢病毒重組載體在抑制濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞(TFH)細(xì)胞活化和分化中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種包含E4BP4基因的慢病毒重組載體，包括E4BP4基因和GV358慢病毒載體；所述E4BP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

優(yōu)選的，所述GV358慢病毒載體的元件順序如下：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。

優(yōu)選的，所述E4BP4基因插入至GV358慢病毒載體多克隆位點(diǎn)的Agel和BamH I酶切位點(diǎn)之間；所述包含E4BP4基因的慢病毒重組載體的元件順序如下：Ubi-E4BP4--3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。

本發(fā)明還提供了所述包含E4BP4基因的慢病毒重組載體的制備方法，包括以下步驟：

1)PCR擴(kuò)增獲得所述E4BP4基因片段；

2)將所述E4BP4基因片段與GV358慢病毒載體分別進(jìn)行雙酶切獲得酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒載體；

3)將步驟2)中所述酶切后的E4BP4基因片段和酶切后的GV358慢病毒載體連接獲得包含E4BP4基因的慢病毒重組載體。

優(yōu)選的，步驟2)中所述雙酶切使用的酶為AgeI酶和BamH I酶。

優(yōu)選的，步驟1)中擴(kuò)增所述E4BP4基因片段的引物對(duì)包括E4BP4-F和E4BP4-R；所述E4BP4-F的序列如SEQID No.2所示；所述E4BP4-R的序列如SEQID No.3所示。

本發(fā)明還提供了一種包括所述包含E4BP4基因的慢病毒重組載體的慢病毒顆粒。