[發明專利]一種軟骨細胞引物層的制備方法及軟骨組織

在審

• 申請號: 201811188565.1
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109251887A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 張輝;李濤;張玉光;王旭;左巖霞;張兆蕾
• 申請（專利權）人: 山東麥德克斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李青

1.一種軟骨細胞引物層的制備方法，其特征在于，將載體和初代自體軟骨細胞進行三維動態共培養，即得；

所述三維動態共培養的培養條件包括：36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO₂，9～11％O₂；

所述三維動態共培養的培養體系中包括9～12ng/mL堿性成纖維細胞生長因子；

在所述三維動態共培養前，所述初代自體軟骨細胞在所述載體中的密度為1.6～2.0×10⁵/cm²；

所述載體包括骨水泥；

所述三維動態共培養的培養體系的組成包括：DMEM培養基、4～5mM L-谷氨酰、體積分數為9～11％的血清和雙抗生素。

2.一種基于人自體細胞的軟骨組織，其特征在于，由權利要求1所述的方法制備得到的軟骨細胞引物層和連接于其上的自體軟骨細胞組成；

所述軟骨細胞引物層用于連接骨和所述自體軟骨組細胞。

3.根據權利要求2所述的軟骨組織，其特征在于，將所述軟骨細胞引物層和培養后的自體軟骨細胞共培養得到所述人工軟骨組織；

優選地，所述軟骨細胞引物層和培養后的自體軟骨細胞共培養為三維動態培養，所述三維動態培養的培養條件包括36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO₂，9～11％O₂。

4.根據權利要求3所述的軟骨組織，其特征在于，所述培養后的自體軟骨細胞由自體軟骨細胞經三維靜態培養后得到；

優選地，所述三維靜態培養為將初代自體軟骨細胞和水凝膠共培養。

5.根據權利要求3所述的軟骨組織，其特征在于，所述初代自體軟骨細胞和水凝膠共培養的方法包括：將所述初代自體軟骨細胞和水凝膠前體溶液混合后，加入膠凝液，形成軟骨細胞和水凝膠復合體，培養后分離出軟骨細胞；

優選地，所述混合時，所述初代自體軟骨細胞的接種密度為0.8×10⁶～1.2×10⁶/mL；

優選地，所述水凝膠在所述水凝膠前體溶液中的質量體積濃度為1.1％～1.3％。

6.根據權利要求5所述的軟骨組織，其特征在于，所述水凝膠包括海藻酸基水凝膠；

優選地，所述水凝膠前體溶液包括藻酸鈉溶液或藻酸鈣溶液；

優選地，所述膠凝液為包括二價陽離子的溶液；所述二價陽離子選自鈣、銅或鋅的一種或多種；

優選地，所述二價陽離子為鈣；

優選地，所述二價陽離子在所述凝膠液中的摩爾濃度為90～110mmol/L。

7.根據權利要求5所述的軟骨組織，其特征在于，所述分離出軟骨細胞的方法包括：清洗后，使用膠原蛋白酶消化，離心即得。

8.根據權利要求3所述的軟骨組織，其特征在于，所述三維靜態培養的培養體系中還包括9～11ng/mL轉化生長因子β，90～110ng/mL胰島素樣生長因子I；

優選地，所述三維靜態培養的培養體系中還包括240～260μg/mL L-抗壞血酸2磷酸鈉。

9.根據權利要求8所述的軟骨組織，其特征在于，所述三維靜態培養的培養體系的組成包括：DMEM培養基、4～5mM L-谷氨酰、體積分數為9～11％的血清和抗生素。

10.根據權利要求3～9任一項所述的軟骨組織，其特征在于，所述軟骨細胞引物層和培養后的自體軟骨組織共培養所用的培養體系與所述三維靜態培養的培養體系相同。