[發(fā)明專利]利用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的方法及其生產(chǎn)的單克隆抗體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811187760.2
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109265539A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設計）人: 張洋
• 申請（專利權）人: 浙江正熙生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 方惠琴

本發(fā)明公開了一種利用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的方法，該方法包括：將復蘇后的雜交瘤細胞置于第一細胞培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)，該第一細胞培養(yǎng)基中血清的體積分數(shù)大于10％；將雜交瘤細胞轉移至第二細胞培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，該第二細胞培養(yǎng)基中血清的體積分數(shù)小于等于10％；將雜交瘤細胞轉移至無血清細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行單克隆抗體的生產(chǎn)。本申請通過采用第一細胞培養(yǎng)基進行“富養(yǎng)”、采用第二細胞培養(yǎng)基進行“均一群養(yǎng)”，確保不同批次的雜交瘤細胞在抗體生產(chǎn)起始時的濃度和體積保持一致，使得整個生產(chǎn)流程可以廣適于不同的雜交瘤細胞株，抗體生長周期穩(wěn)定；在無血清細胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)單克隆抗體，抗體產(chǎn)品質量高。

技術領域

本發(fā)明屬于雜交瘤細胞培養(yǎng)和單克隆抗體生產(chǎn)技術領域，具體涉及一種利用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的方法及其生產(chǎn)的單克隆抗體。

背景技術

雜交瘤細胞(hybridoma)是用骨髓瘤細胞和單克隆的B細胞融合成的細胞，其融合細胞既具有骨髓瘤細胞無限復制的能力，也具有成熟的單克隆B漿細胞不斷分泌單克隆抗體的功能?？贵w工業(yè)生產(chǎn)上利用這種融合細胞進行單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn)，這種融合細胞被稱為雜交瘤細胞。

傳統(tǒng)的采用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的生產(chǎn)方案一般是將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這種方法生產(chǎn)的單克隆抗體的純度只有80-90％。為了提高抗體純度，現(xiàn)有技術中對用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的生產(chǎn)方案進行了改進，改進方案主要有兩種：

(1)低含量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的生產(chǎn)方案：首先將雜交瘤細胞從液氮保存罐中取出并進行細胞復蘇，復蘇后將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中傳代(傳代5天)，傳代后將雜交瘤細胞培養(yǎng)在胎牛血清的濃度為2％的低血清RPMI培養(yǎng)液中進行擴大雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)和抗體生產(chǎn)，抗體生產(chǎn)時間約為20天。

這種生產(chǎn)方案的不足之處在于，(a)雜交瘤細胞在2％的胎牛血清RPMI培養(yǎng)液中完成單克隆抗體的生產(chǎn)，但胎牛血清中仍舊存在較多蛋白，直接導致雜交瘤細胞分泌的抗體純度不高，造成后續(xù)產(chǎn)品純度(約90％)和質量較差；(b)整個生產(chǎn)周期需要25天，周期較長；(c)由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分較低，較多種類雜交瘤細胞在2％的低血清RPMI培養(yǎng)液中無法完成擴大培養(yǎng)。

(2)胎牛血清含量梯度下降的雜交瘤細胞培養(yǎng)方案：首先將雜交瘤細胞從液氮保存罐中取出并進行細胞復蘇，復蘇后將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中傳代(傳代5天)，傳代后將雜交瘤細胞先后在含10％,8％,6％,4％,2％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)后(一共培養(yǎng)15天)，最后將雜交瘤細胞轉移到無血清的雜交瘤細胞培養(yǎng)基(如，賽默飛Gibco CD hybridoma medium)進行擴大培養(yǎng)和抗體生產(chǎn)，抗體生產(chǎn)時間為15天。

該生產(chǎn)方案的不足之處在于：(a)雜交瘤細胞在轉移到無血清培養(yǎng)基之前有為期15天的胎牛血清RPMI培養(yǎng)液血清濃度漸降培養(yǎng)過程，導致生產(chǎn)周期延長了15天，整個抗體生產(chǎn)周期至少需要35天；(b)在血清漸降培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞難以保持最佳的生長狀態(tài)，抗體生產(chǎn)質量堪憂，且人為操作會導致細胞培養(yǎng)狀態(tài)批次間不穩(wěn)定，最終將導致抗體產(chǎn)品批次間質量不穩(wěn)定；(c)不同雜交瘤細胞對血清漸降過程的適應程度不同，導致不同種類的雜交瘤細胞的生產(chǎn)周期差異性大，針對不同的雜交瘤細胞的生產(chǎn)流程無法達到一致化；(d)雜交瘤細胞在2％的胎牛血清RPMI培養(yǎng)液中完成單克隆抗體的生產(chǎn)，但胎牛血清中仍舊存在較多蛋白，直接導致雜交瘤細胞分泌的抗體純度不高，造成后續(xù)產(chǎn)品純度(約90％)和質量仍較差。

針對上述問題，目前的主流解決思路是開發(fā)新的無血清培養(yǎng)基，以在保證雜交瘤細胞具有良好生長狀態(tài)的同時盡可能提高單克隆抗體的純度。但無血清培養(yǎng)基的開發(fā)目前還未獲得突破性進展，生產(chǎn)的單克隆抗體的質量和產(chǎn)量依舊不高。

發(fā)明內容

本申請的發(fā)明目的是提供一種生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)的單克隆抗體純度高的利用雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體的方法。