[發明專利]利用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的方法及其生產的單克隆抗體

在審

• 申請號: 201811187760.2
• 申請日: 2018-10-12
• 公開（公告）號: CN109265539A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 張洋
• 申請（專利權）人: 浙江正熙生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 方惠琴

本發明公開了一種利用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的方法，該方法包括：將復蘇后的雜交瘤細胞置于第一細胞培養基中進行傳代培養和擴大培養，該第一細胞培養基中血清的體積分數大于10％；將雜交瘤細胞轉移至第二細胞培養基中進行擴大培養，該第二細胞培養基中血清的體積分數小于等于10％；將雜交瘤細胞轉移至無血清細胞培養基中培養，進行單克隆抗體的生產。本申請通過采用第一細胞培養基進行“富養”、采用第二細胞培養基進行“均一群養”，確保不同批次的雜交瘤細胞在抗體生產起始時的濃度和體積保持一致，使得整個生產流程可以廣適于不同的雜交瘤細胞株，抗體生長周期穩定；在無血清細胞培養基中生產單克隆抗體，抗體產品質量高。

技術領域

本發明屬于雜交瘤細胞培養和單克隆抗體生產技術領域，具體涉及一種利用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的方法及其生產的單克隆抗體。

背景技術

雜交瘤細胞(hybridoma)是用骨髓瘤細胞和單克隆的B細胞融合成的細胞，其融合細胞既具有骨髓瘤細胞無限復制的能力，也具有成熟的單克隆B漿細胞不斷分泌單克隆抗體的功能。抗體工業生產上利用這種融合細胞進行單克隆抗體的規模化生產，這種融合細胞被稱為雜交瘤細胞。

傳統的采用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的生產方案一般是將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養基中培養，這種方法生產的單克隆抗體的純度只有80-90％。為了提高抗體純度，現有技術中對用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的生產方案進行了改進，改進方案主要有兩種：

(1)低含量血清培養基培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體的生產方案：首先將雜交瘤細胞從液氮保存罐中取出并進行細胞復蘇，復蘇后將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養基中傳代(傳代5天)，傳代后將雜交瘤細胞培養在胎牛血清的濃度為2％的低血清RPMI培養液中進行擴大雜交瘤細胞擴大培養和抗體生產，抗體生產時間約為20天。

這種生產方案的不足之處在于，(a)雜交瘤細胞在2％的胎牛血清RPMI培養液中完成單克隆抗體的生產，但胎牛血清中仍舊存在較多蛋白，直接導致雜交瘤細胞分泌的抗體純度不高，造成后續產品純度(約90％)和質量較差；(b)整個生產周期需要25天，周期較長；(c)由于培養基營養成分較低，較多種類雜交瘤細胞在2％的低血清RPMI培養液中無法完成擴大培養。

(2)胎牛血清含量梯度下降的雜交瘤細胞培養方案：首先將雜交瘤細胞從液氮保存罐中取出并進行細胞復蘇，復蘇后將雜交瘤細胞置于含10％胎牛血清的RPMI培養基中傳代(傳代5天)，傳代后將雜交瘤細胞先后在含10％,8％,6％,4％,2％胎牛血清的RPMI培養基中傳代培養后(一共培養15天)，最后將雜交瘤細胞轉移到無血清的雜交瘤細胞培養基(如，賽默飛Gibco CD hybridoma medium)進行擴大培養和抗體生產，抗體生產時間為15天。

該生產方案的不足之處在于：(a)雜交瘤細胞在轉移到無血清培養基之前有為期15天的胎牛血清RPMI培養液血清濃度漸降培養過程，導致生產周期延長了15天，整個抗體生產周期至少需要35天；(b)在血清漸降培養過程中，雜交瘤細胞難以保持最佳的生長狀態，抗體生產質量堪憂，且人為操作會導致細胞培養狀態批次間不穩定，最終將導致抗體產品批次間質量不穩定；(c)不同雜交瘤細胞對血清漸降過程的適應程度不同，導致不同種類的雜交瘤細胞的生產周期差異性大，針對不同的雜交瘤細胞的生產流程無法達到一致化；(d)雜交瘤細胞在2％的胎牛血清RPMI培養液中完成單克隆抗體的生產，但胎牛血清中仍舊存在較多蛋白，直接導致雜交瘤細胞分泌的抗體純度不高，造成后續產品純度(約90％)和質量仍較差。

針對上述問題，目前的主流解決思路是開發新的無血清培養基，以在保證雜交瘤細胞具有良好生長狀態的同時盡可能提高單克隆抗體的純度。但無血清培養基的開發目前還未獲得突破性進展，生產的單克隆抗體的質量和產量依舊不高。

發明內容

本申請的發明目的是提供一種生產周期短、生產的單克隆抗體純度高的利用雜交瘤細胞生產單克隆抗體的方法。