[發明專利]一種PD1人源化BALB/c小鼠模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201811179743.4
• 申請日: 2018-10-10
• 公開（公告）號: CN109266656B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 琚存祥;趙靜;李松;楊笑柳;張明坤;侯歡歡;高翔
• 申請（專利權）人: 江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N15/113;A01K67/027
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 孫倩倩

本發明提供了一種制備PD1人源化BALB/c小鼠模型的方法，該方法利用CRIPSR/Cas9技術，通過構建打靶載體，利用同源重組的方式將小鼠PD1大部分胞外區人源化，胞內區仍為小鼠序列，保留了完整的胞內信號傳導能力，應用該方法構建的人源化模型，實現了人源區域(抗體結合域)最大化，避免錯過有效的抗體。同時以BALB/c為背景構建的PD1人源化模型，可接種結直腸癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、腎癌及淋巴癌等，滿足各類實體腫瘤細胞系類型，并且拓展了應用的廣泛性。

技術領域

本發明屬于動物基因工程和基因遺傳修飾領域，具體地說，涉及基于CRISPR/Cas9技術的PD1基因修飾人源化動物模型的構建方法及其在生物醫藥的應用。

背景技術

早在2013年，Science雜志就將腫瘤免疫療法評為10大科學突破之首，其中以PD1/PDL1為首的免疫檢查點療法(Immuno-checkpoint therapy)已在多種癌癥臨床治療中顯示出顯著的抗腫瘤療效。目前已有上市并用于臨床的成功藥物，默沙東公司的PD-1人源化抗體Keytruda(Pembrolizumab，MK-3475)及百時美施貴寶公司的PD-1抗體Opdivo(Nivolumab)于2014年被FDA批準上市的一線腫瘤治療藥物，有穩健的抗腫瘤作用。同時國內已有15個PD-1/PD-L1類藥物(國產)申報臨床，包括10個PD-1單抗和4個PD-L1單抗，1個PD-L1單域抗體。截止目前，恒瑞醫藥非小細胞肺癌及食管癌研發已進入三期臨床，信達生物非小細胞肺癌研發也進入三期臨床，而君實生物及百濟神州的PD1研發均在二期臨床取得顯著療效，主要適應癥為實體癌。

臨床研究表明，PD1抗體在部分腫瘤或病人體內，無顯著響應，而采用PD1與化療藥物聯用，會顯著提高患者響應。Keytruda二期臨床試驗中，通過聯合標準療法(紫杉醇、多環比星與環磷酸胺)，對局部晚期的三陰性乳腺癌患者，或HR+/HER2-乳腺癌患者有著積極的療效。患者的病理完全緩解率從20％上升到了60％。在HR+/HER2-乳腺癌患者中，組合療法也將該數字從13％提升到了34％。

人源化小鼠模型是指帶有人類功能性基因、人類細胞或組織的小鼠模型。人類疾病的發病機制研究，篩選有效的治療藥物，均需要大量的動物模型來進行臨床前試驗。小鼠因其個體小，飼養管理方便，易于控制，生產繁殖快等特點，廣泛被用于生物模型。但由于小鼠生理特征與人存在較多差異，利用動物模型得到的實驗結果有時不能適用到人體上。然而利用基因修飾或細胞與組織移植的方法，將人類基因或細胞組織“放置”在小鼠模型上所制備的人源化小鼠模型，極大程度上模擬人類基因或細胞組織的相關活動，大大提高了這類小鼠模型作為模擬某些人類疾病的有效性。

PD1(programmed death 1)為CD28超家族成員，屬于免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，是一種重要的免疫抑制分子。大量研究證實，腫瘤微環境中的腫瘤細胞表面PDL1增高，同時與活化的T細胞上的PD1結合，傳遞負性調控信號，導致腫瘤抗原特異性T細胞的凋亡或免疫無能，從而抑制免疫反應，進而促使腫瘤細胞的逃逸。

PD1人源化小鼠是指將鼠源的PD1基因替換為人源的基因。該小鼠模型可用于抗體及小分子藥物的篩選和評價。該模型與普通小鼠相比，關鍵的靶分子實現了人源化改造，并且保留了完整的免疫系統，可用于篩選和評價針對人類基因的藥物，是非常理想的臨床前藥物測試模型。

BALB/c和C57BL/6均為常用的腫瘤藥效評價小鼠，現有的人源化PD1主要是在C57BL/6背景上進行，但從兩種背景小鼠可接種的實體瘤對比表(見表一)可見，BALB/c小鼠的種類和多樣性更豐富，且BALB/c小鼠常用于免疫相關研究。就前期PD1抑制劑在各類小鼠腫瘤上的敏感度比較，C57BL/6常用荷瘤MC38對PD1抑制劑較為敏感，易被壓制。而BALB/c常用荷瘤CT26對于PD1響應度偏低且不均一，更能反應現有藥物在不同人體內的真實情況。

表1.BALB/c及C57BL/6背景鼠可接種實體瘤對比