[發(fā)明專利]一種花生突變體的快速篩選方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811173302.3
• 申請日: 2018-10-09
• 公開（公告）號: CN109156352A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王晶珊;禹山林;喬利仙;隋炯明;楊慶利;李冠;趙明霞;姜德鋒;郭寶太;朱虹
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/04
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 賈文健

1.一種花生突變體的快速篩選方法，其特征在于：對花生離體誘變獲得的再生苗，采用SSR方法進行基因型上的突變性鑒定，淘汰基因型未突變的再生苗，鑒定的基因型突變的再生苗即為花生突變體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述花生突變體的快速篩選方法，其特征在于：步驟為：

(1)提取誘變親本花生品種和誘變后再生苗葉片的全基因組DNA，進行SSR的PCR擴增；

(2)對比誘變親本花生和誘變后再生苗的SSR擴增結(jié)果，選擇擴增結(jié)果呈現(xiàn)多態(tài)性的再生苗即為花生突變體，淘汰基因型未突變的再生苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述花生突變體的快速篩選方法，其特征在于：所述擴增結(jié)果呈現(xiàn)多態(tài)性是指擴增片段減少、擴增片段增加或擴增片段長度差異。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述花生突變體的快速篩選方法，其特征在于：所述SSR的PCR擴增結(jié)果的檢測方法為：

將擴增產(chǎn)物在8％非變性PAGE凝膠上電泳，電泳緩沖液位1×TBE，每個點樣孔加1.5μL樣品，200伏恒電壓下電泳約90分鐘，電泳結(jié)束后，進行銀染檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述花生突變體的快速篩選方法，其特征在于：

所述SSR的PCR擴增體系為：模板1.5μL，Taq酶0.2μL，10×Taq buffer 7.5μL，正反向引物各0.6μL，ddH₂O 4.6μL；

所述SSR的PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性13min，55℃退火1min，72℃延長90s，34個循環(huán)；72℃延長10min。

6.權(quán)利要求1～5任一項所述花生突變體的快速篩選方法在花生育種上的應(yīng)用。

7.一種花生快速育種方法，其特征在于：步驟如下：

(1)選擇顆粒飽滿的花生種子進行誘變育種；

(2)經(jīng)誘變處理的花生種子去子葉，取種胚，對種胚進行表面消毒處理；

(3)將消毒后的種胚置于無菌水中浸泡10～14h后，分離浸泡處理后種胚的胚小葉；

(4)將胚小葉作為外植體置于添加10mg/L 2,4-D的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周，誘導(dǎo)體胚形成；

(5)將形成體胚的胚小葉外植體轉(zhuǎn)移到添加4mg/LBAP的體胚萌發(fā)和再生培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)體胚萌發(fā)成再生苗，每4周繼代培養(yǎng)一次；

(6)采用SSR方法篩選基因型發(fā)生突變的再生苗為花生突變體，淘汰基因型未突變的再生苗；

(7)將花生突變體無菌嫁接到砧木上，經(jīng)煉苗后種植于大田，收獲種子；

(8)將收獲的種子連續(xù)自交至M₅代，通過生育期間及收獲后性狀觀察和/或種子營養(yǎng)成分測定，選擇各種變異的花生突變體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述花生快速育種方法，其特征在于：所述的表面消毒處理為：將種胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，最后用無菌水漂洗5次。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述花生快速育種方法，其特征在于：

所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+10mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8；

所述體胚萌發(fā)和再生培養(yǎng)基為MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述花生快速育種方法，其特征在于：

所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)、體胚萌發(fā)和再生培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度為25～26℃、光照強度為2000～3000Lx、每日光照為12～15h。