[發明專利]一種提取水培植物基因組DNA的試劑盒及提取方法

在審

• 申請號: 201811172858.0
• 申請日: 2018-10-09
• 公開（公告）號: CN109136219A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 王學敏;張錦錦;崔苗苗;溫紅雨
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

本發明屬于DNA提取方法領域，具體涉及一種提取水培植物基因組DNA的試劑盒及提取方法。所述試劑盒包括樣品緩沖液、DNA提取液、體積比24:1的氯仿：異戊醇混合液、異丙醇、體積分數70％～75％的乙醇溶液、ddH₂O、纖維素酶，所述樣品緩沖液為100～150g/L的葡萄糖溶液。所述方法包括材料預處理、提取、除蛋白、沉淀、清洗、溶解等步驟。本發明的試劑盒和方法在DNA的提取過程中避免使用液氮，提高試劑的使用方便度，減少液氮凍傷操作者手部的風險，耗時短。

技術領域

本發明屬于DNA提取方法領域，具體涉及一種提取水培植物基因組DNA的試劑盒及提取方法。

背景技術

DNA是動植物遺傳物質，其在研究物種進化，生理功能方面具有重要作用。CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法是傳統且較為常見的植物DNA提取方法。CTAB法提取DNA的原理如下：利用CTAB在高離子強度的緩沖液中與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，但不沉淀核酸的特性，用離心獲得含DNA的上清液，用氯仿和異戊醇混合液使蛋白質變性、分層，同時除去脂類的方法，達到提取和純化DNA的目的。傳統的CTAB方法雖然適用于大部分動植物以及微生物DNA的提取，但因其耗時長，所以現有技術針對不同的樣品做了不同的改進。

以“改進的CTAB提取植物DNA方法，李榮華，實驗室研究與探索，2009年”記載的方法為例，該文獻記載的方案針對的是植物葉片樣本DNA的提取，經過改進后，CTAB法提取DNA主要包括(1)液氮研磨樣品步驟，耗時15min左右，(2)DNA提取液提取步驟，耗時45min左右，DNA提取液是CTAB、NaCl、EDTA、Tris-HCl、β-巰基乙醇、水的混合物，(3)除蛋白步驟，耗時20min左右，(4)異丙醇沉淀步驟，耗時1h以上，(5)乙醇溶液清洗、干燥步驟，耗時30min左右。該方法總計耗時2小時50分鐘以上。上述改進的CTAB方法縮短了提取時間，可以使學生在較短的時間內直接觀察到DNA的絲狀沉淀，也可以在瓊脂糖電泳中確定出提取的DNA分子的大小。

但是，由于上述方法采用的液氮研磨，液氮溫度非常低，液氮的存儲和使用均不太方便，且易凍傷操作者手部，因此，有必要進一步對CTAB方法進行改進，以期在縮短DNA提取時間的同時，避免使用液氮。

發明內容

本發明提供的一種提取水培植物基因組DNA的試劑盒及提取方法，縮短了DNA提取時間，為提高科研和教學效率奠定了基礎。

本發明的第一個目的是提供一種提取水培植物基因組DNA的試劑盒，包括樣品緩沖液、DNA提取液、體積比24:1的氯仿：異戊醇混合液、異丙醇、體積分數70％～75％的乙醇溶液、ddH₂O、纖維素酶；

所述樣品緩沖液為100～150g/L的葡萄糖溶液；

所述DNA提取液的配方如下：CTAB 2g、NaCl 1.4mol、0.5mol/L pH8.0的EDTA溶液4mL、1mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液10mL、β-巰基乙醇2.5mL，雙蒸水定容至100mL。

優選的，所述的提取水培植物基因組DNA的試劑盒，所述樣品緩沖液為100g/L的葡萄糖溶液或者150g/L的葡萄糖溶液。

本發明的第二個目的是提供一種利用所述的試劑盒提取水培植物基因組DNA的方法，包括以下步驟：

S1，樣品預處理：將采集的水培植物組織與樣品緩沖液混合，研磨5～10min，加入樣品75mg/mL的纖維素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；

S2，提取：向破壁溶液中加入1～2倍體積的DNA提取液，混勻，65℃水浴加熱20～40min，離心，收集上清液；

S3，除蛋白：向上清液中加入等體積的體積比24:1的氯仿：異戊醇混合液，上下顛倒混勻3min，靜置幾秒，吸取上層溶液；