[發明專利]靶向HPV亞型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系統

在審

• 申請號: 201811166552.4
• 申請日: 2018-10-08
• 公開（公告）號: CN111004800A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 仇建萍;周宋峰;吉怡;李鐵軍;朱遠源
• 申請（專利權）人: 百奧邁科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/864;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種用于對人乳頭瘤病毒HPV亞型16/18的癌基因E6/E7進行基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其包含Cas9和分別靶向癌基因E6/E7的兩種sgRNA，所述sgRNA是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2：或者是選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意兩種。本發明的CRISPR/Cas9系統可用于制備宮頸癌治療藥物。

技術領域

本發明屬于屬于分子生物學領域，具體地說，涉及一種用于對人乳頭瘤病毒HPV亞型16/18的癌基因E6/E7進行基因編輯的CRISPR/Cas9系統、及其在制備宮頸癌治療藥物中的用途。

背景技術

宮頸癌的發生與人乳頭瘤病毒(HPV)的感染密切相關。已知的HPV亞型16和亞型18兩種病毒造成了70％以上的宮頸癌病例。臨床治療宮頸癌是手術切除，放射治療，化療。雖然防治人類乳頭瘤病毒感染已有疫苗產品市售，但是成年人在已經接觸到HPV16/18感染后，疫苗幾乎無效。

HPV病毒是一個小的雙鏈環狀DNA病毒(7.9kb)。位于早期區的E6、E7基因是HPV病毒的致癌基因。E6表達會使腫瘤抑制蛋白p53降解，而E7基因的表達，抑制pRb活性，使細胞周期調節紊亂。E6/E7兩者共同作用，導致細胞的永生化，引發癌癥。因此阻斷E6/E7癌蛋白表達，可恢復p53和pRbd的正常表達，引起癌細胞凋亡。同時，由于切斷了病毒E6/E7基因，阻斷病毒增殖，理論上可達到清除機體中病毒的目的。

CRISPR系統(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是在細菌及古細菌種發現的一種抵御質粒病毒感染的免疫機制，其通過生物工程設計一段作為引導工具的小核酸，引導一種名叫Cas9的特殊核酸酶到特定基因組，對生物的DNA序列進行切割或替換。CRISPR/Cas9技術有許多潛在的應用，可以用于人類基因組編輯以治療遺傳缺陷病或基因突變疾病；刪除病原體基因，如細菌的基因組或病毒基因組，消滅病原體，達到消除傳染性疾病。CRISPR基因編輯技術是徹底治愈遺傳缺陷疾病和傳染性疾病的有效方法和希望。

為了能有效治療宮頸癌，發明人研究了使用CRISPR基因編輯技術的可能性。通過切斷人類乳頭瘤病毒癌蛋白E6、E7基因，破壞癌蛋白表達，從感染機體中消除病毒。結合子宮頸癌的手術治療和化療，清除患者體內的HPV病毒，讓患者避免重復感染，達到治愈子宮頸癌目的。

發明內容

在基因編輯技術的研究中，發明人對靶向人乳頭瘤病毒癌基因E6/E7基因序列的sgRNA(single guide RNA，單導向RNA)進行了大量的篩選，發現有17種sgRNA能夠高效率地靶向E6/E7，其中的5種sgRNA能夠以表達載體比如雙靶表達質粒形式在細胞內表達，產生的sgRNA分子可高效地引導核酸酶Cas9靶向癌基因E6和E7，切割E6/E7癌基因，導致了癌細胞的死亡。

因此，本發明的第一個目的在于提供一種用于

一種用于對人乳頭瘤病毒HPV亞型16/18的癌基因E6/E7進行基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其包含核酸內切酶Cas9和分別靶向癌基因E6/E7的兩種sgRNA，所述sgRNA是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2：

5’-UUUCAAUGGUGUCAAUACGU-3’(SEQ ID NO:1)，

5’-GCGAAGCCAACACGCAUGUUU-3’(SEQ ID NO:2)；或者

所述sgRNA是選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意兩種：

5’-GUUCGAUGGACUAGACACGU-3’(SEQ ID NO:3)，

5’-CGUCGACAAAGACUUGUGGG-3’(SEQ ID NO:4)，