[發明專利]靶向HPV亞型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系統

在審

• 申請號: 201811166552.4
• 申請日: 2018-10-08
• 公開（公告）號: CN111004800A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 仇建萍;周宋峰;吉怡;李鐵軍;朱遠源
• 申請（專利權）人: 百奧邁科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/864;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

1.一種用于對人乳頭瘤病毒HPV亞型16/18的癌基因E6/E7進行基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其包含核酸內切酶Cas9和分別靶向癌基因E6/E7的兩種sgRNA，所述sgRNA是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2：

5’-UUUCAAUGGUGUCAAUACGU-3’(SEQ ID NO:1)，

5’-GCGAAGCCAACACGCAUGUUU-3’(SEQ ID NO:2)；或者

所述sgRNA是選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意兩種：

5’-GUUCGAUGGACUAGACACGU-3’(SEQ ID NO:3)，

5’-CGUCGACAAAGACUUGUGGG-3’(SEQ ID NO:4)，

5’-CAACUGGAAGAUACAGUGCU-3’(SEQ ID NO:5)。

2.如權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述Cas9是來自金黃色葡萄球菌的SaCas9，識別的PAM為5’-NNGRRT-3’，其中N指A、T、C、G；R指A、G。

3.如權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述sgRNA以單鏈RNA分子形式存在、或者以表達載體形式存在。

4.如權利要求3所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，當sgRNA以表達載體形式存在時，兩種sgRNA即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2被克隆在同一個表達載體上，形成雙靶表達載體；或者

SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意兩種被克隆在同一個表達載體上，形成雙靶表達載體。

5.如權利要求4所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，sgRNA表達載體上的sgRNA表達基因是互補雙鏈DNA序列，其中

SEQ ID NO:1的表達基因由如下正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-TGCATAACTGTGGTAACTTT-3’(SEQ ID NO:6)，

反義鏈：5’-AAAGTTACCACAGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:7)；

SEQ ID NO:2的表達基因由如下正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-TTTGTACGCACAACCGAAGCG-3’(SEQ ID NO:8)，

反義鏈：5’-CGCTTCGGTTGTGCGTACAAA-3’(SEQ ID NO:9)；

SEQ ID NO:3的表達基因由如下正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-TGCACAGATCAGGTAGCTTG-3’(SEQ ID NO:10)，

反義鏈：5’-CAAGCTACCTGATCTGTGCA-3’(SEQ ID NO:11)；

SEQ ID NO:4的表達基因由如下正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-GGGTGTTCAGAAACAGCTGC-3’(SEQ ID NO:12)，

反義鏈：5’-GCAGCTGTTTCTGAACACCC-3’(SEQ ID NO:13)；

SEQ ID NO:5的表達基因由如下正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-TCGTGACATAGAAGGTCAAC-3’(SEQ ID NO:14)，

反義鏈：5’-GTTGACCTTCTATGTCACGA-3’(SEQ ID NO:15)。

6.如權利要求5所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述雙靶表達框上第一個sgRNA基因的啟動子是人U6啟動子；第二個sgRNA基因的啟動子是小鼠U6啟動子突變體mU6，選自SEQ ID NO:16-27。

7.如權利要求4所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，所述雙靶表達載體的骨架質粒是腺相關病毒AAV，雙靶表達框的兩端是腺相關病毒基因組反向末端重復序列ITR。