[發明專利]一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA、gRNA組合物以及電轉方法

在審

• 申請號: 201811166259.8
• 申請日: 2018-09-30
• 公開（公告）號: CN109706148A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 祝海寶;陶米林;黃雨亭;張栩琳;阮錦輝
• 申請（專利權）人: 廣東赤萌醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10;A61K48/00;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

本發明提供了一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA、gRNA組合物、表達載體、CRISPR?Cas9 RNP、CRISPR?Cas9 RNP組合物、CRISPR?Cas9系統、電轉方法和試劑盒及其用途，本發明使用CRISPR?Cas9技術，對造血干細胞的BCL11A基因進行靶向切割，使得BCL11A基因表達量下降，從而使胎兒血紅蛋白表達量提高，有望作為地中海貧血和鐮刀型貧血癥治療的新手段。使用CRISPR?Cas9技術實現BCL11A基因的突變，設計簡單、使用便捷、成本低且效率高。

技術領域

本發明涉及一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA、 gRNA組合物以及電轉方法。

背景技術

血紅蛋白病是影響新生兒健康甚至存活率的遺傳性疾病，每年新生患兒超過330000例，主要有鐮刀型貧血和地中海貧血兩種地中海貧血是一種珠蛋白基因缺陷而引起的遺傳性慢性貧血，以β和α型較為常見。目前發現α-地貧的基因突變型至少有81種(46種點突變，35種缺失突變)；β-地貧的基因突變型至少有186種，主要為點突變。我國是地貧高發國之一，病例分布于廣東、廣西、海南、貴州、云南、四川、重慶、福建、湖南、湖北、江西等地，其中廣東和廣西兩省地貧基因缺陷率分別高達10％和20％，病例數占全國總數的2/5以上，已成為社會性的公共衛生問題。并由于多省尚未將地貧篩查納入孕檢常規項目，且近年取消了強制性婚檢，加上部分地區基層醫務人員對該病認知水平不高，導致近年地貧患兒出生率有上升趨勢。鐮刀型貧血癥為常染色體隱性遺傳病。患者因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，使鐮狀血紅蛋白(HbS)取代了正常Hb(HbA)。在氧分壓下降時HbS分子間相互作用，成為溶解度很低的螺旋形多聚體，使紅細胞扭曲成鐮狀細胞(鐮變)。臨床表現為慢性溶血性貧血、易感染和再發性疼痛危象以致慢性局部缺血導致器官組織損害。鐮刀型貧血主要見于非洲黑人，也見于中東、希臘、意大利等地中海沿岸國家以及印度、印第安等，還有與上述地區和民族長期通婚的人群，我國南方也有發現。雜合子狀態者占非洲黑人的20％，占美國黑人的8％，雜合子之間通婚子女有1/4幾率為純合子，即導致鐮刀型貧血癥。該病嚴重危害母子健康，可使胎兒死亡率達 5％，孕婦死亡率達4.62％。

地中海貧血和鐮刀型貧血患者主要通過規范性長期輸血和去鐵治療來緩解病癥，但這種方式不但不能治愈，也帶來較高的臨床安全隱患。造血干細胞移植是目前唯一能根治地中海貧血和鐮刀型貧血的治療技術，多以骨髓造血干細胞和臍血干細胞異體移植為主。骨髓配型是限制干細胞異體移植的關鍵問題，即使配型成功還是有產生免疫排斥的風險，在臨床上難以大范圍應用。雖然理論上臍血配型相較骨髓簡單，同胞臍血移植能夠徹底治愈重型地中海貧血和鐮刀型貧血癥，非同胞臍血干細胞移植配型成功的幾率也相對較大，但在我國公共臍血庫不完善的環境下，要在臨床上大規模推廣仍然是困難重重。

自體造血干細胞移植無疑可以完全解決上述配型和免疫排斥問題，但是患者自身的造血干細胞也同樣存在基因缺陷，無法直接用于治療。然而，在體外通過基因編輯手段修正自體干細胞的基因缺陷或者對相關調控基因進行編輯，然后將基因修正后的干細胞移植回患者體內，不僅可以修復患者天生的基因缺陷或改變相關基因的表達調控，還避免了免疫排斥的安全風險，是最直接有效的治療方式。更重要的是，體外遺傳工程改造的自體造血干細胞移植，可以挽回眾多地貧和鐮刀型貧血癥患者在無盡的配型等待中消逝的生命，使得配型不再是阻礙地貧和鐮刀型貧血癥治療的關鍵問題。

然而，地中海貧血和鐮刀型貧血的基因突變型有很多種，要針對每位患者的突變型設計一套基因修正方案，理論上可行，但在實際開發工作中難以實現所有突變類型的全覆蓋，況且就目前基因編輯技術的發展水平而言，對其中某些突變點的修正還是難以實現的。如何研究開發一種對所有類型的地中海貧血和鐮刀型貧血都適用的基因修正方案用于自體造血干細胞移植，已成為迫切的主題。

BCL11A基因，編碼一個C2H2型鋅指結構蛋白，具有抑制胎兒血紅蛋白的表達的功能。研究發現，下調或抑制BCL11A的表達可提高胎兒血紅蛋白的表達量，從而對地中海貧血和鐮刀型貧血癥有治療作用。