[發明專利]一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA、gRNA組合物以及電轉方法

在審

• 申請號: 201811166259.8
• 申請日: 2018-09-30
• 公開（公告）號: CN109706148A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 祝海寶;陶米林;黃雨亭;張栩琳;阮錦輝
• 申請（專利權）人: 廣東赤萌醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10;A61K48/00;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

1.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:34中的一種所示。

2.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的gRNA組合物，其特征在于，所述gRNA組合物由靶序列如SEQ ID NO:24所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA組成，或由靶序列如SEQ ID NO:25所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA組成，或由靶序列如SEQ ID NO:26所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA組成，或由SEQID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:32所示的gRNA組成，或由靶序列如SEQ ID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA組成，或由靶序列如SEQ ID NO:32所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA組成。

3.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的表達載體，其特征在于，所述表達載體是將如權利要求1所述的gRNA對應的DNA序列連接到基礎載體上而得的，所述表達載體表達得到如權利要求1所述的gRNA。

4.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的表達載體，其特征在于，所述表達載體是將如權利要求2所述的gRNA組合物對應的DNA序列連接到基礎載體上而得的，所述表達載體表達得到如權利要求2所述的gRNA組合物。

5.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的CRISPR-Cas9系統，其特征在于，包括如權利要求1所述的gRNA、如權利要求2所述的gRNA組合物中的至少一種，以及Cas9蛋白。

6.根據權利要求5所述的CRISPR-Cas9系統，其特征在于，所述Cas9蛋白為來源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白或來源于Staphylococcus aureus的Cas9蛋白。

7.一種CRISPR-Cas9 RNP，其特征在于，所述CRISPR-Cas9 RNP是由如權利要求1所述的gRNA與Cas9蛋白在體外形成的。

8.一種CRISPR-Cas9 RNP組合物，其特征在于，所述CRISPR-Cas9 RNP組合物包括SEQID NO:31 RNP和SEQ ID NO:32 RNP的組合物、SEQ ID NO:31 RNP和SEQ ID NO:34 RNP的組合物或者SEQ ID NO:32 RNP和SEQ ID NO:34 RNP的組合物。

9.一種用于敲除造血干細胞BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的的電轉方法，其特征在于，所述方法是采用細胞電轉儀將權利要求7所述的CRISPR-Cas9 RNP或者權利要求8所述的CRISPR-Cas9 RNP組合物導入造血干細胞。

10.一種采用如權利要求9所述的電轉方法得到的造血干細胞。

11.一種用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增強子的試劑盒，其特征在于，包括：

(1)表達Cas9蛋白的載體、Cas9蛋白和Cas9蛋白對應的mRNA中的至少一種；

(2)如權利要求1所述的gRNA、如權利要求2所述的gRNA組合物、表達如權利要求1所述的gRNA的載體和表達如權利要求2所述的gRNA組合物的載體中的至少一種。

12.如權利要求1所述的gRNA、如權利要求2所述的gRNA組合物、如權利要求3或4所述的表達載體、如權利要求5或6所述的CRISPR-Cas9系統、如權利要求7所述的CRISPR-Cas9RNP、如權利要求8所述的CRISPR-Cas9 RNP組合物、如權利要求10所述的造血干細胞在制備治療地中海貧血或者鐮刀型貧血的藥物中的用途。