[發(fā)明專利]一種金針菇多糖二維指紋圖譜的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811165676.0
• 申請(qǐng)日: 2018-10-08
• 公開（公告）號(hào): CN109001359A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡秋輝;董禹彤;裴斐;楊文建;方勇;馬寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N21/3563
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 鄧麗;王偉

本發(fā)明涉及一種金針菇多糖二維指紋圖譜的構(gòu)建方法，屬于食用菌、功能食品及其制品的指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括金針菇多糖的提取，對(duì)提取的金針菇多糖進(jìn)行紅外光譜分析和對(duì)其酸水解產(chǎn)物PMP衍生化進(jìn)行HPLC單糖組成分析，構(gòu)建了金針菇多糖的紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，根據(jù)紅外光譜和HPLC色譜共有特征峰的相對(duì)峰面積，應(yīng)用主成分分析進(jìn)行金針菇多糖的識(shí)別檢測(cè)。本發(fā)明方法具有操作方便、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建的金針菇多糖二維指紋圖譜可對(duì)未知來(lái)源的金針菇多糖進(jìn)行質(zhì)量控制，比一維指紋圖譜可信度更高，為食用菌的質(zhì)量檢測(cè)提供了一種新型簡(jiǎn)易的鑒定方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食用菌、功能食品原料及其制品的指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用金針菇多糖二維指紋圖譜對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

背景技術(shù)

金針菇別名冬菇、樸蕈、構(gòu)菌等，屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、金錢菌屬。廣泛分布于中國(guó)、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地。在我國(guó)，金針菇栽培歷史十分悠久，2017年中國(guó)金針菇年產(chǎn)量已超過(guò)300萬(wàn)噸，是世界上金菇針菇產(chǎn)量最多的國(guó)家。

金針菇所含的金針菇多糖具有多種生物活性，但由于復(fù)雜的提取過(guò)程及各種其他因素的影響，金針菇多糖的質(zhì)量參差不齊，金針菇多糖產(chǎn)品的真?zhèn)瘟驾y以鑒別。金針菇多糖產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)業(yè)及消費(fèi)人群需要一種有效的金針菇多糖產(chǎn)品質(zhì)量的鑒別方法。然而，目前對(duì)于金針菇類產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的研究還相對(duì)較少，沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，未確立科學(xué)有效的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種金針菇多糖二維指紋圖譜的構(gòu)建方法，并能通過(guò)二維指紋圖譜對(duì)金針菇多糖進(jìn)行質(zhì)量控制，為金針菇多糖的質(zhì)量控制提供一種快速有效的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

1.金針菇多糖二維指紋圖譜的構(gòu)建：

（1）金針菇多糖的提?。簩⑿迈r的金針菇于50℃熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥，然后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎制得金針菇粉。稱取一定量的金針菇粉，按照料液比1:25在80℃熱水浴條件下浸提4 h，8000 r/min條件下離心10min，上清液加入Sevag試劑（正丁醇:三氯甲烷=1:4，v/v），10000r/min條件下離心15min除去蛋白，向其中加入剩余上清液體積4倍的無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，離心后取沉淀用3500Da孔徑規(guī)格透析袋，4℃透析72h，真空濃縮后冷凍干燥，備用；

（2）金針菇多糖紅外光譜分析及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建：將20批不同產(chǎn)地、不同顏色和不同栽培方式的金針菇多糖烘干至恒重，稱取3-5 mg的多糖樣品與與100-200 mg溴化鉀在瑪瑙研缽中混合研磨后壓片，在4000cm^-1-400cm^-1波長(zhǎng)范圍，2cm^-1分辨率條件下掃描32次，得到20種金針菇多糖的紅外光譜圖，建立金針菇多糖的紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

（3）金針菇多糖HPLC單糖組成分析及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立：吸取100 μL濃度為4 mg/mL的多糖溶液于具塞試管中，加入100 μL 4 M三氟乙酸溶液，混勻后用N₂密封，置于110 ℃烘箱中水解120 min，冷卻至室溫后加入200 μL甲醇，用N₂吹干以除去殘留的三氟乙酸，重復(fù)4次，將干燥的樣品用100 μL超純水溶解；取100 μL多糖水解液與等體積100 μL 0.6 M氫氧化鈉溶液混合，吸取50 μL的混合溶液，加入50 μL 0.5 M的PMP甲醇溶液混勻，于70 ℃下反應(yīng)100 min后冷卻至室溫，用50 μL 0.3 M鹽酸溶液中和，加入超純水補(bǔ)齊至1 mL，然后加入1mL的三氯甲烷，渦旋靜置分層后棄去有機(jī)相，重復(fù)此步驟3次，吸取水相過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析，得到金針菇多糖HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。