[發明專利]一種金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法

在審

• 申請號: 201811165676.0
• 申請日: 2018-10-08
• 公開（公告）號: CN109001359A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 胡秋輝;董禹彤;裴斐;楊文建;方勇;馬寧
• 申請（專利權）人: 南京財經大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N21/3563
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 鄧麗;王偉

1.一種金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將新鮮金針菇子實體于50℃熱風循環烘箱干燥，然后粉碎至80目，用于提取金針菇多糖；

（2）對得到的金針菇多糖進行紅外光譜分析和對其酸水解產物PMP衍生化進行HPLC單糖組成分析，構建金針菇多糖的紅外標準指紋圖譜和HPLC標準指紋圖譜；

（3）將得到的紅外光譜經SNV光譜預處理后，運用主成分分析進行判別；對得到的HPLC圖譜的共有峰面積數據運用主成分分析進行判別。

2.根據權利要求1所述的金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法，其特征在于，金針菇多糖的提取步驟包括：稱取一定量的金針菇粉，按照料液比1:25在80℃熱水浴條件下浸提4h，8000 r/min條件下離心10min；上清液中加入Sevag試劑（正丁醇:三氯甲烷=1:4，v/v），10000r/min條件下離心15min除去蛋白，向其中加入剩余上清液體積4倍的無水乙醇沉淀過夜，離心后取沉淀用3500Da孔徑規格透析袋，4℃透析72h，真空濃縮后冷凍干燥，備用。

3.根據權利要求1所述的金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）金針菇多糖紅外光譜標準指紋圖譜的構建

稱取3-5mg的多糖樣品與100-200mg溴化鉀在瑪瑙研缽中混合研磨后壓片，在4000cm^-1-400cm^-1波長范圍，2cm^-1分辨率條件下掃描32次，根據不同品種金針菇多糖的傅里葉變換紅外光譜圖，得到金針菇多糖紅外光譜的標準指紋圖譜；

（2）金針菇多糖HPLC標準指紋圖譜的構建

吸取100μL濃度為4 mg/mL的多糖溶液于具塞試管中，加入100μL 4 M三氟乙酸溶液，混勻后用N₂密封，置于110 ℃烘箱中水解120 min，冷卻至室溫后加入200 μL甲醇，用N₂吹干以除去殘留的三氟乙酸，重復4次，將干燥的樣品用100μL超純水溶解；取100μL多糖水解液與等體積100 μL0.6 M氫氧化鈉溶液混合，吸取50μL的混合溶液，加入50μL0.5 M的PMP甲醇溶液混勻，于70℃下反應100min后冷卻至室溫，用50μL0.3 M鹽酸溶液中和，加入超純水補齊至1mL，然后加入1 mL的三氯甲烷，渦旋靜置分層后棄去有機相，重復此步驟3次，吸取水相過0.45μm微孔濾膜過濾后進行分析，得到金針菇多糖的HPLC標準指紋圖譜。

4.根據權利要求3所述的金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法，其特征在于，步驟（2）中，HPLC色譜條件為：ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱，4.6mm×250 mm，5μm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；流動相：0.1 M磷酸鹽（pH 6.7）緩沖液/乙腈，體積比為83:17；檢測波長：250nm；進樣體積：20μL。

5.根據權利要求1所述的金針菇多糖二維指紋圖譜的構建方法，其特征在于，所述金針菇多糖紅外光譜標準指紋圖譜有9個特征共同峰，分別為3383.24 cm^-1、2932.73 cm^-1、2138.10 cm^-1、1647.48 cm^-1、1422.57 cm^-1、1248.20 cm^-1、1078.69 cm^-1、889.75 cm^-1、573.52 cm^-1。