[發(fā)明專利]葡萄漿果內壞死病毒侵染性克隆及其構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811157115.6
• 申請日: 2018-09-30
• 公開（公告）號: CN109266643B
• 公開（公告）日: 2022-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 范旭東;董雅鳳;張尊平;任芳;胡國君
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院果樹研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/34;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

本發(fā)明公開了一種葡萄漿果內壞死病毒侵染性克隆及其構建方法。該侵染性克隆載體是將分段擴增的葡萄漿果內壞死病毒基因組片段通過無縫克隆方式，連接至含有雙35S啟動子和核酶HDV?RZ的pCB301?2x35S?HDV_RZ?NOS載體而獲得。通過凍融法將此載體轉入農桿菌EHA105感受態(tài)細胞，并通過農桿菌接種西方煙草和葡萄驗證其侵染性。本發(fā)明構建的GINV侵染性克隆能夠在農桿菌EHA105菌株中穩(wěn)定、高效表達，并能成功侵染西方煙草和葡萄寄主。GINV侵染性克隆的獲得，使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，為后續(xù)開展GINV的生物學特性和致病性研究提供有力的工具。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及葡萄漿果內壞死病毒侵染性克隆及其構建方法。

背景技術

1984年于日本巨峰葡萄上首次發(fā)現(xiàn)葡萄漿果內壞死病(最早稱花葉病)，該病在日本山梨縣葡萄園造成嚴重危害。一些敏感品種(如巨峰、先鋒、立川無核、康拜爾早生)感染該病后，植株生長減弱，春季萌芽延遲，并且表現(xiàn)莖內壞死、短節(jié)、花葉、果粒小、果外變色和果內壞死等癥狀。病株摩擦接種菎諾藜后，發(fā)現(xiàn)了一種大小為740×12nm的線形病毒，命名為葡萄漿果內壞死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus，GINV)。GINV屬發(fā)狀病毒屬(Trichovirus)的成員之一，其基因組由3個開放閱讀框組成，分別編碼復制酶(RP)、移動蛋白(MP)和外殼蛋白(CP)。2016年，該病毒在我國葡萄上首次報道，并初步表明GINV與葡萄表現(xiàn)褪綠斑駁和環(huán)斑癥狀發(fā)生相關。對來自我國15個省(市)自治區(qū)的195個葡萄樣品進行GINV檢測，結果顯示GINV在我國葡萄上的檢出率為35.9％，在表現(xiàn)明顯環(huán)斑癥狀的葡萄上的檢出率為94.1％，已嚴重影響了我國葡萄的產量和品質。作為國內新報道的一個葡萄病毒，有必要對其致病性進行深入研究，為其危害規(guī)律及綜合防控技術研究提供理論依據(jù)。

開展病毒致病性研究，對于今后病毒病的防控至關重要。葡萄病毒在田間多復合侵染，因此，很難將一種葡萄病毒與某一特定的癥狀聯(lián)系起來。對于一些新的葡萄病毒，往往通過田間癥狀觀察、大量樣品的病毒檢測、病毒序列分析、嫁接傳毒實驗等研究，來明確病毒與田間癥狀的相關性。由于葡萄病毒均難純培養(yǎng)，很難完成柯赫氏法則的第三條規(guī)則(即將純培養(yǎng)接種到相同品種的健康植株上，出現(xiàn)癥狀相同的病害)，因此，大部分葡萄病毒與某一病害之間的關系均沒有直接的證據(jù)證明。

病毒侵染性克隆是病毒致病性研究的有力工具，可用于證明病毒與病害的關系，完成病毒的柯赫氏法則。病毒侵染性克隆的構建是將病毒全長cDNA片段插入到來源花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S強力啟動子的下游，從而啟動病毒cDNA在真核植物中轉錄，獲得具有侵染性的病毒RNA。采用侵染性克隆接種無病毒植物，可明確病毒與植物病害之間的關系。目前，尚未發(fā)現(xiàn)關于構建侵染葡萄的發(fā)狀病毒屬病毒侵染性全長cDNA克隆的報道，且GINV與病害發(fā)生的直接關系尚未證明。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是如何快速、高效的構建得到葡萄漿果內壞死病毒(GINV)侵染性全長cDNA克隆。

第一方面，本發(fā)明保護一種葡萄漿果內壞死病毒侵染性全長cDNA克隆的構建方法。

本發(fā)明提供的葡萄漿果內壞死病毒侵染性全長cDNA克隆的構建方法包括如下步驟：將葡萄漿果內壞死病毒基因組全長cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄漿果內壞死病毒基因組全長cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通過無縫克隆方式連接至植物表達載體中，得到含有葡萄漿果內壞死病毒全長cDNA的重組表達載體；所述重組表達載體即為葡萄漿果內壞死病毒侵染性全長cDNA克隆；

所述葡萄漿果內壞死病毒基因組全長cDNA序列如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述植物表達載體含有35S啟動子和核酶(HDV-RZ)基因。所述35S啟動子用于啟動所述葡萄漿果內壞死病毒全長cDNA的表達。所述核酶基因的作用是當重組表達載體在植物體內表達后，核酶可在合適的位置切下GINV病毒基因組。