[發(fā)明專利]葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性克隆及其構(gòu)建方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201811157115.6 | 申請(qǐng)日： | 2018-09-30 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN109266643B | 公開（公告）日： | 2022-01-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 范旭東;董雅鳳;張尊平;任芳;胡國(guó)君 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/10 | 分類號(hào)： | C12N15/10;C12N15/34;C12N1/21;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245 | 代理人： | 關(guān)暢;陳曉慶 |
| 地址： | 125100 遼寧省葫蘆島市興*** | 國(guó)省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 葡萄 漿果 壞死 病毒 侵染 克隆 及其 構(gòu)建 方法 | ||
1.一種葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將葡萄漿果內(nèi)壞死病毒基因組全長(zhǎng)cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄漿果內(nèi)壞死病毒基因組全長(zhǎng)cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通過無縫克隆方式連接至植物表達(dá)載體中，得到含有葡萄漿果內(nèi)壞死病毒全長(zhǎng)cDNA的重組表達(dá)載體；所述重組表達(dá)載體即為葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆；
將葡萄漿果內(nèi)壞死病毒基因組全長(zhǎng)cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄漿果內(nèi)壞死病毒基因組全長(zhǎng)cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通過無縫克隆方式連接至植物表達(dá)載體中的方法如下：
1)以葡萄漿果內(nèi)壞死病毒的cDNA為模板，分別采用5'half1a/1b和3'half2a/2b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到GINV 5'擴(kuò)增片段和GINV 3'擴(kuò)增片段；所述GINV 5'擴(kuò)增片段為含有序列1第1-4978位所示的DNA分子；所述GINV 3'擴(kuò)增片段為含有序列1第4962-7229位所示的DNA分子；
5'half1a：catttcatttggagaggcctGATAAGTAGTTGACAGTGATCAATTG；
5'half1b：agacatcaaAGGCCTCGTAATCAGATTC；
3’half2a：cgaggcctTTGATGTCTCACAGGACC；
3’half2b：ccatgccgacccggggatccT(40)GGAAATTAATTAAAAC；其中“T(40)”代表堿基T的個(gè)數(shù)為40；
2)用限制性內(nèi)切酶Stu I和Sma I對(duì)pCB301-2x35S-HDVRZ-NOS載體進(jìn)行雙酶切，得到雙酶切后的載體；
3)利用無縫克隆試劑盒將所述雙酶切的載體與所述GINV 5'擴(kuò)增片段和所述GINV 3'擴(kuò)增片段進(jìn)行連接，得到所述重組表達(dá)載體；
所述葡萄漿果內(nèi)壞死病毒基因組全長(zhǎng)cDNA序列如序列表中序列1所示。
2.利用權(quán)利要求1所述方法制備得到的葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆。
3.含有權(quán)利要求2所述的葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆的重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為含有所述葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆的農(nóng)桿菌。
5.權(quán)利要求2所述的葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性克隆或權(quán)利要求3或4所述的重組菌在制備單一病毒侵染植物模型中的應(yīng)用；所述單一病毒為葡萄漿果內(nèi)壞死病毒。
6.權(quán)利要求2所述的葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性克隆或權(quán)利要求3或4所述的重組菌在研究葡萄漿果內(nèi)壞死病毒生物學(xué)特性和/或致病機(jī)理中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的葡萄漿果內(nèi)壞死病毒侵染性克隆或權(quán)利要求3或4所述的重組菌在研究葡萄漿果內(nèi)壞死病毒與宿主植物互作中的應(yīng)用。
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