[發(fā)明專(zhuān)利]一種發(fā)酵液中衣康酸含量的測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811156905.2
• 申請(qǐng)日: 2018-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109061009B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張居舟;程堅(jiān);李靜;汪永信;劉毅;張安;王璟秋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 合肥市澤信專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 34144
• 代理人: 方榮肖

本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵液中衣康酸含量的測(cè)定方法，該方法包括：試樣中的衣康酸經(jīng)甲醇?水溶液提取或直接稀釋?zhuān)?jīng)強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱凈化，磷酸?甲醇溶液洗脫，再利用反相色譜柱分離，液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。本發(fā)明可排除衣康酸發(fā)酵液中可能存在的木糖、蔗糖、葡萄糖、果糖等糖和檸檬酸的干擾，該方法的回收率高，精密度好，準(zhǔn)確可靠，能對(duì)衣康酸的含量測(cè)定起到質(zhì)量控制的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)酵液及成品中衣康酸的含量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種發(fā)酵液中衣康酸含量的測(cè)定方法。

背景技術(shù)

衣康酸(Itaconic acid)又稱(chēng)甲叉丁二酸、亞甲基丁二酸、亞甲基琥珀酸，是世界上5大有機(jī)酸之一。由于其含不飽和雙鍵，具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，能進(jìn)行各種加成反應(yīng)、聚合反應(yīng)和酯化反應(yīng)，是化學(xué)合成和化工生產(chǎn)的重要工業(yè)原料，在化纖、塑料、橡膠、醫(yī)藥、食品、合成樹(shù)脂及表面活性劑領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，隨著衣康酸具有的獨(dú)特性能被認(rèn)識(shí)及應(yīng)用范圍的迅速擴(kuò)大，迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確地測(cè)定發(fā)酵液中衣康酸含量的分析方法。

目前，傳統(tǒng)發(fā)酵液中的有機(jī)酸多采用酶法或高效液相色譜法測(cè)定，還原糖采用DNS法(3，5-二硝基水楊酸比色法)測(cè)定。酶法和還原糖法分析過(guò)程繁瑣費(fèi)時(shí)，現(xiàn)在的研究人員多采用色譜儀分析發(fā)酵液的成分。馬瑞等使用離子排斥液相色譜法同時(shí)分析了生物質(zhì)發(fā)酵液中6種有機(jī)酸和3種糖類(lèi)物質(zhì)。劉蘭等利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定土曲霉發(fā)酵液中衣康酸及葡萄糖。朱進(jìn)拴等利用電導(dǎo)檢測(cè)器的有機(jī)酸分析系統(tǒng)測(cè)定衣康酸的含量。

當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)主要集中在衣康酸發(fā)酵液中的衣康酸和常見(jiàn)代謝產(chǎn)物的分析，多采用示差檢測(cè)器。而以淀粉(或糖質(zhì))為原料，經(jīng)微生物深層發(fā)酵的發(fā)酵液是一種懸浮物、固形物較多、粘度較大、色度很深，一般富含殘?zhí)恰⒂袡C(jī)酸、色素、蛋白等雜質(zhì)，此類(lèi)雜質(zhì)難免會(huì)對(duì)衣康酸的分離產(chǎn)生干擾，從殘?zhí)窃谧贤夤鈪^(qū)幾乎無(wú)吸收的角度從發(fā)，建立一種快速、準(zhǔn)確地測(cè)定發(fā)酵液中衣康酸含量的分析方法對(duì)于該技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為填補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，提供了一種發(fā)酵液中衣康酸含量的高效液相色譜檢測(cè)方法，該方法選用固相萃取柱凈化，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，為日常檢驗(yàn)工作提供可靠技術(shù)支持。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種發(fā)酵液中衣康酸含量的測(cè)定方法，該測(cè)定方法具體步驟如下：

S1、試樣處理：

提取：取適量發(fā)酵液，離心處理后，稱(chēng)取定量的上清液于容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

凈化：取定量上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速，棄去流出液，用甲醇-水溶液淋洗，再用磷酸-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，置于氮吹管中，氮吹至干后，用磷酸溶液-甲醇溶液震蕩溶解殘?jiān)?jīng)有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，得到供高效液相色譜儀分析用的試樣溶液；

優(yōu)選地，所述步驟S1的具體操作步驟如下：

提取：取適量發(fā)酵液，離心處理后，稱(chēng)取上清液1.00g于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液溶解，并定容；

凈化：取1.00mL上述定容后的溶解液至固相萃取柱中，控制流速為0.5mL/min，棄去流出液，用1mL甲醇-水溶液淋洗，再用4mL的2％磷酸-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，置于氮吹管中，50℃氮吹至干后，用1.00mL的0.1％磷酸溶液-甲醇溶液震蕩溶解殘?jiān)?jīng)0.45μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，得到供高效液相色譜儀分析用的試樣溶液。

優(yōu)選地，所述的固相萃取柱采用強(qiáng)陰離子固相萃取柱，規(guī)格為：1000mg、6mL；使用前，依次用4mL甲醇、4mL水以及4mL甲醇-水溶液對(duì)強(qiáng)陰離子固相萃取柱進(jìn)行活化處理。

其中，所述的甲醇-水溶液中甲醇與水的體積比為1:1；所述的2％磷酸-甲醇溶液是由體積比為1:50的磷酸和甲醇混合而成。