[發(fā)明專利]一種MRFFT1細胞

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811153232.5
• 申請日: 2018-09-30
• 公開（公告）號: CN109136278B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 焦順昌;張嶸;周子珊;宋玉潔;解佳森;張?zhí)熨x;王海燕;袁翰
• 申請（專利權）人: 北京鼎成肽源生物技術有限公司;焦順昌
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發(fā)明涉及一種MRFFT1細胞及其制備方法，通過抗原表位預測篩選出突變多肽，連接并合成突變多肽表達基因序列；同時構建MVA病毒載體，包裝MVA病毒，轉染APC細胞，完成特異性MV細胞的改造，體外與從外周血中分離的PBMC共培養(yǎng)，篩選出有效多肽，通過精準有效多肽刺激的第二次沖擊，將普通T細胞改造成為具有更精準殺傷能力的RFF細胞，再利用TCR－T技術原理進行了改造，改造后的T細胞再用基因編緝技術對其進行免疫抑制靶點的敲除，精準的保護了特異性殺傷T細胞免受體內抑制，提高了T細胞對腫瘤細胞的殺傷力。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種MRFFT1細胞及其制備方法。

背景技術

目前，在腫瘤的特異性免疫治療方面，現有的LAK、DC、CIK、DC-CIK細胞和方法基本被證明是無效的，而NK、CAR-NK、TIL等細胞技術還有待成熟，CAR－T細胞在安全性和實體瘤治療中還有缺陷。現有技術一般通過改造DC細胞，由DC遞呈T細胞產生特異殺傷。有些實驗室在嘗試用病毒做為載體的方法進行轉染遞呈T細胞，誘導T細胞的特異性殺傷。我們也曾用突變混合多肽直接刺激PBMC，誘導T細胞。還有實驗室利用TCR-T技術，靶向遞呈MAGE A3抗原。

以上治療方法并不成熟，尤其是體外誘導DC細胞及DC細胞負載腫瘤抗原技術理論上研究較多，但在具體實施過程中還有許多問題，缺乏明確的、腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展關鍵的信號傳導通路相關分子作為誘導抗原，因為腫瘤抗原不明及腫瘤微環(huán)境免疫抑制的障礙，使實現特異性細胞靶向免疫治療難以順利實施。另外，有的雖然進行了抗原體外沖擊，但沒有進行體外共培育和體外擴增，讓較為單薄的特異性細胞直接面對復雜的腫瘤免疫微環(huán)境，因此，很難起到預期的效果。也有的雖然也可以體外遞呈和共培育，但靶點單一(MAGE-3)，僅對非小細胞肺癌等個別癌種起效。雖然也有嘗試慢毒為載體的方法進行轉染遞呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而簡單混合多肽的直接刺激，雖然簡單方便，但效率較低。特異性精準多肽的二次刺激不如T細胞受體轉導的腫瘤特異性抗原更直接。現有的TCR-T在治療血液腫瘤和實體腫瘤的解決方案中，缺乏覆蓋更多瘤種的精準的TCR。

上述方案均沒有考慮T細胞的自我防護技術，使得數量不多的特異性T細胞直接面對強大的腫瘤免疫微環(huán)境。

發(fā)明內容

本發(fā)明通過使用人源外周血進行ctDNA測序或腫瘤組織進行全外顯子測序，篩選出突變位點進行抗原表位預測，連接并合成突變多肽表達基因序列；同時構建MVA病毒載體，包裝MVA病毒，轉染APC細胞，完成特異性MV細胞的改造，體外與從外周血中分離的PBMC共培養(yǎng)，篩選出有效多肽，通過精準有效多肽刺激的第二次沖擊，將普通T細胞改造成為具有更精準殺傷能力的RFF細胞，再利用TCR－T技術原理進行了改造，改造后的T細胞再用基因編緝技術對其進行免疫抑制靶點的敲除，精準的保護了特異性殺傷T細胞免受體內抑制，提高了T細胞對腫瘤細胞的殺傷力。

本發(fā)明提供的MRFFT1細胞可廣泛應用于個體化精準治療實體腫瘤。

對于專用名詞的解釋：

M：MVA病毒轉染技術

R：精準多肽二次沖擊技術

FF：混合多肽技術

T：TCR-T技術

1：靶點敲除防護技術

例如：MRFFT1細胞，即經由上述M、R、FF、T、1各項技術方案或技術手段改造而獲得的細胞。

MRFFT1細胞改造方案：

1、抗原表位預測