[發(fā)明專(zhuān)利]一種在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811151129.7
• 申請(qǐng)日: 2018-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110964749A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田克恭;王同燕;孫進(jìn)忠;張?jiān)S科
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司;洛陽(yáng)惠中生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/866
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/866
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營(yíng)

本發(fā)明提供了一種在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白的方法，該方法通過(guò)在pFastbac Dual質(zhì)粒中p10啟動(dòng)子和多角體啟動(dòng)子之后分別克隆外源蛋白基因，同時(shí)在p10啟動(dòng)子和多角體啟動(dòng)子之間插入同源重復(fù)序列，使得表達(dá)的外源蛋白量大大增加，表達(dá)的外源蛋白保持了其原有的免疫原性。本發(fā)明的表達(dá)外源蛋白的方法高效，低成本，能用于大量制備疫苗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，涉及桿狀病毒高效表達(dá)外源蛋白的方法。

背景技術(shù)

桿狀病毒是一類(lèi)雙鏈DNA病毒，自然界中主要感染鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲(chóng)。桿狀病毒基因組可以插入較大片段外源基因、表達(dá)外源蛋白，表達(dá)的外源蛋白具有較好的修飾加工，具有良好的生物學(xué)活性，至今已用桿狀病毒表達(dá)的蛋白有千種，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已被公認(rèn)為是優(yōu)良的表達(dá)系統(tǒng)。

然而，如何提高桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)量一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的方向，多數(shù)是通過(guò)改造桿狀病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)提高外源蛋白表達(dá)量。雖然經(jīng)過(guò)改造的桿狀病毒在一定程度上提高了外源蛋白的表達(dá)量，但是桿狀病毒的改造都是針對(duì)具體外源基因來(lái)進(jìn)行的特定改造，不適合其他的外源蛋白的高效表達(dá)，不具有通用性，當(dāng)需要表達(dá)其他的外源基因時(shí)，還需要重新對(duì)其他的外源基因進(jìn)行改造。因此，需要提供一種應(yīng)用范圍更廣、針對(duì)不同蛋白的桿狀病毒高效表達(dá)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白的方法，其中，所述方法包括：步驟(1)將AcMNPV基因組中同源重復(fù)序列插入AcMNPV的p10啟動(dòng)子(P_p10)和多角體啟動(dòng)子(P_PH)之間，獲得之間插入了同源重復(fù)序列的P_p10和P_PH序列；步驟(2)將所述外源蛋白基因各一個(gè)拷貝分別插入到pFastbac Dual質(zhì)粒中P_p10和P_PH之后，獲得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因雙表達(dá)盒的pFastbac Dual質(zhì)粒；步驟(3)將所述步驟(1)獲得的之間插入了同源重復(fù)序列的P_p10和P_PH序列替換掉所述步驟(2)中所述pFastbac Dual質(zhì)粒上的相鄰的P_p10和P_PH，獲得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因的雙表達(dá)盒及所述雙表達(dá)盒之間插入了同源重復(fù)序列的質(zhì)粒；步驟(4)將所述步驟(3)獲得的包含雙拷貝外源基因及同源重復(fù)序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組Bacmid質(zhì)粒；步驟(5)將所述步驟(4)獲得的所述重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒；以及步驟(6)培養(yǎng)所述步驟(5)得到的重組桿狀病毒，收獲上清，得到表達(dá)的所述外源蛋白。

本發(fā)明方法通過(guò)改造桿狀病毒，使得外源蛋白高效表達(dá)，能顯著提高外源蛋白的表達(dá)量，表達(dá)量能提高一倍或以上。且本發(fā)明方法可應(yīng)用到多種外源蛋白的高效表達(dá)，具有廣泛的適用范圍。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白的方法中，所述步驟(1)中所述的同源重復(fù)序列為Hr3，Hr3為SEQ ID.No.7所示；或所述的同源重復(fù)序列為Hr1，Hr1為SEQ ID.No.8所示。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白的方法中，所述步驟(1)中的所述之間插入了同源重復(fù)序列的P10和PH啟動(dòng)子的連續(xù)序列如SEQ ID.No.1或SEQ ID.No.2所示。