[發明專利]一種在桿狀病毒表達系統中高效表達外源蛋白的方法及其應用

在審

• 申請號: 201811151129.7
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN110964749A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 田克恭;王同燕;孫進忠;張許科
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司;洛陽惠中生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

1.一種在桿狀病毒表達系統中高效表達外源蛋白的方法，其中，所述方法包括：步驟(1)將AcMNPV基因組中同源重復序列插入AcMNPV的P_p10和P_PH之間，獲得之間插入了同源重復序列的P_p10和P_PH序列；步驟(2)將所述外源蛋白基因各一個拷貝分別插入到pFastbac Dual質粒中P_p10和P_PH之后，獲得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因雙表達盒的pFastbac Dual質粒；步驟(3)將所述步驟(1)獲得的之間插入了同源重復序列的P_p10和P_PH序列替換掉所述步驟(2)中所述pFastbac Dual質粒上的相鄰的P_p10和P_PH，獲得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因的雙表達盒及所述雙表達盒之間插入了同源重復序列的質粒；步驟(4)將所述步驟(3)獲得的包含雙拷貝外源基因及同源重復序列的質粒轉化DH10Bac感受態細胞，獲得重組Bacmid質粒；步驟(5)將所述步驟(4)獲得的所述重組Bacmid質粒轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒；以及步驟(6)培養所述步驟(5)得到的重組桿狀病毒，收獲上清，得到表達的所述外源蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(1)中所述的同源重復序列為Hr3，Hr3為SEQ ID.No.7所示；或所述的同源重復序列為Hr1，Hr1為SEQ ID.No.8所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(1)中的所述之間插入了同源重復序列的P_p10和P_PH序列如SEQ ID.No.1或SEQ ID.No.2所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(2)中所述外源蛋白基因包括禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽減蛋綜合征病毒Penton蛋白、禽減蛋綜合征病毒Fiber蛋白、雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白、豬圓環病毒3型Cap蛋白、豬圓環病毒2型Cap蛋白、豬偽狂犬病病毒gB蛋白、豬偽狂犬病病毒gD蛋白、豬細小病毒VP2蛋白、豬瘟病毒E2蛋白、牛傳染性鼻氣管炎病毒gB蛋白、牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸蟲GALE蛋白、日本血吸蟲Wnt5蛋白。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述步驟(5)中的昆蟲細胞為sf21、sf9、或Highfive細胞。