[發(fā)明專利]一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811149789.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN109134657A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐靜;田青青;陳星星;周義正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波奧丞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;C07K1/34;C07K14/77;C12N15/06
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 梁永昌

本發(fā)明公開了一種25?羥基維生素D3的抗體制備方法，包括人工抗原制備、動(dòng)物免疫及脾細(xì)胞制備、骨髓瘤細(xì)胞的制備、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選和亞克隆、25?羥基維生素D3單克隆抗體純化等步驟，由于25?羥基維生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本發(fā)明將25?羥基維生素D3偶聯(lián)卵清白蛋白獲得25?羥基維生素D3人工抗原，所制備的25?羥基維生素D3單克隆抗體具有效價(jià)高、親和力好，與25?羥基維生素D3抗原結(jié)合力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于免疫熒光、酶聯(lián)免疫或磁微粒免疫技術(shù)等來定性或定量檢測(cè)人體中25?羥基維生素D3表達(dá)水平，臨床輔助預(yù)防及治療佝僂病、骨軟化病和嬰兒手足搐搦癥。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法。

背景技術(shù)

血清25羥基維生素D3是合成25-OH-VD3的前體，是維生素D的主要循環(huán)形式，其半壽期較長(zhǎng),血中濃度較穩(wěn)定，可直接反映機(jī)體維生素D的水平，維生素D參與不但鈣磷代謝的調(diào)節(jié)作用，近年來維生素D被證實(shí)具有更為廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和免疫學(xué)效應(yīng)，包括用以預(yù)防及治療佝僂病、骨軟化病和嬰兒手足搐搦癥，抑制多種類型細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能等。因此，血清中的25羥維生素D3已經(jīng)成為健康體檢的重要指標(biāo)。

現(xiàn)在有越來越多公司參與開發(fā)25羥維生素D3檢測(cè)試劑盒，高品質(zhì)的抗體，是開發(fā)25羥維生素D3檢測(cè)試劑盒的關(guān)鍵技術(shù)和基礎(chǔ)，但是當(dāng)前的25羥維生素D3檢測(cè)試劑盒，無論使用哪種技術(shù)，放射免疫法，膠體金，酶聯(lián)免疫法，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，磁微粒免疫技術(shù)，都不能得到與HPLC精確測(cè)試相媲美的結(jié)果，因此需進(jìn)一步研發(fā)出一種25-羥基維生素D3單克隆抗體，可用于能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)25-羥基維生素D3的免疫檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，制備的抗體特異性好，親和力高，能夠用于25-羥基維生素D3免疫熒光檢測(cè)試劑盒，對(duì)人體內(nèi)25-羥基維生素D3蛋白做出準(zhǔn)確的檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，包括如下步驟：

(1)25-羥基維生素D3人工抗原制備：將25-羥基維生素D3蛋白與N,N二甲基酰胺混合均勻后，加入三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，加入氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)，得到活化的25-羥基維生素D3蛋白；將OVA(卵清白蛋白)溶于超純水中，通過氫氧化鈉調(diào)整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25-羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液透析，重復(fù)2次，再用超純水透析，重復(fù)2次，即得25-羥基維生素D3人工抗原；

(2)動(dòng)物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周進(jìn)行抗原沖擊，25-羥基維生素D3人工抗原尾靜脈注射，3天后，取效價(jià)高小鼠的免疫脾細(xì)胞，將免疫脾細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中；

(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，融合前1天，進(jìn)行細(xì)胞換液并使細(xì)胞在融合當(dāng)天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段；

(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前4天，處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，消毒后在無菌的條件下，取小鼠腹腔細(xì)胞，即飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基將沉淀飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮，將上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；