[發(fā)明專利]一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811149789.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109134657A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐靜;田青青;陳星星;周義正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波奧丞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;C07K1/34;C07K14/77;C12N15/06
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 梁永昌

1.一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)25-羥基維生素D3人工抗原制備：將25-羥基維生素D3蛋白與N,N二甲基酰胺混合均勻后，加入三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，加入氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)，得到活化的25-羥基維生素D3蛋白；將OVA溶于超純水中，通過(guò)氫氧化鈉調(diào)整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25-羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液透析，重復(fù)2次，再用超純水透析，重復(fù)2次，即得25-羥基維生素D3人工抗原；

(2)動(dòng)物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周進(jìn)行抗原沖擊，25-羥基維生素D3人工抗原尾靜脈注射，3天后，取效價(jià)高小鼠的免疫脾細(xì)胞，將免疫脾細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中；

(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，融合前1天，進(jìn)行細(xì)胞換液并使細(xì)胞在融合當(dāng)天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段；

(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前4天，處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，消毒后在無(wú)菌的條件下，取小鼠腹腔細(xì)胞，即飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基將沉淀飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮，將上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；

(5)細(xì)胞融合：將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，放入融合管中，離心機(jī)離心，棄上清；將1mL 50％PEG4000沿轉(zhuǎn)動(dòng)的管壁滴入，60s內(nèi)加完，在5min內(nèi)加入25mL DMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，離心機(jī)離心，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，輕輕吹打使沉淀細(xì)胞懸??；將細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后第7天每孔用HAT完全培養(yǎng)液半換液，融合后第14天用HT完全培養(yǎng)基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養(yǎng)液換液；

(6)細(xì)胞篩選：融合細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/10面積時(shí)，用碳酸鹽緩沖液將25-羥基維生素D3人工抗原稀釋為5ug/ml，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過(guò)夜，棄去孔內(nèi)液體，磷酸鹽緩沖液清洗2次，每孔加封閉液4℃過(guò)夜，經(jīng)洗滌液洗滌后，加入待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，孵育，經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，孵育，再經(jīng)洗滌液洗滌后，加入含3％H2O2的鄰苯二胺底物液顯色，以H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD值，選擇OD值比陰性對(duì)照高5-10倍的雜交瘤細(xì)胞再克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存；

(7)亞克?。翰捎密洯傊▽?duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，克隆數(shù)次，直至到100％細(xì)胞陽(yáng)性率，最終得到高特異性25-羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株；

(8)抗體純化：將上述高特異性25-羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)10⁵/ml以上時(shí)停止加液，再持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞培養(yǎng)液變黃后收集培養(yǎng)液，離心機(jī)離心，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，將過(guò)濾后的上清液置于protein-A親合層析柱中，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱去除雜蛋白，再以5倍柱體積的甘氨酸溶液洗脫被吸附的抗體蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH為7.2，再以10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液透析16小時(shí)后，透析后的樣品再經(jīng)濾膜過(guò)濾后即獲得純化的25-羥基維生素D3單克隆抗體。

2.如權(quán)利要求1所述的一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，步驟(2)中，小鼠的免疫量為100ul/只/次。

3.如權(quán)利要求1所述的一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，步驟(6)中，洗滌液為0.1％Tween20的磷酸鹽緩沖液。

4.如權(quán)利要求1所述的一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，步驟(6)中，封閉液為含2％BSA的磷酸鹽緩沖液。

5.如權(quán)利要求1所述的一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，步驟(5)中，DMEM培養(yǎng)的加入速度為：第lmin內(nèi)加1mL，第2min內(nèi)加4mL，剩余20mL在5min內(nèi)加完。