[發明專利]一種基于二代測序的通過血漿檢測微衛星穩定狀態和基因組變化的方法

有效

• 申請號: 201811149011.0
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109207594B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 劉成林;漢雨生;張之宏;張周;段飛蝶
• 申請（專利權）人: 廣州燃石醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;G16B30/00;G16H50/30
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張曉飛

本發明涉及一種基于二代測序，通過血漿檢測微衛星不穩定(MSI)和疾病相關基因變異的方法，實施該方法的設備，尤其是該檢測方法在癌癥，優選結直腸癌(例如腸癌)、胃癌或子宮內膜癌患者的無創診斷，預后評估，選擇治療方案或遺傳篩查中的用途，并基于該檢測方法獲得了高度靈敏性及特異性的用于檢測癌癥，優選結直腸癌(例如腸癌)、胃癌或子宮內膜癌相關的微衛星不穩定(MSI)位點。本申請還涉及血漿微衛星不穩定檢測中所用的試劑盒和檢測試劑在制備試劑盒中的用途。本申請首次提供了血漿MSI檢測方法，可以以高準確度高靈敏度判斷樣本的微衛星(MS)狀態。

發明領域

本發明涉及生物標志物組合，檢測其的試劑盒，及其在血漿樣本中的微衛星穩定狀態檢測和癌癥，優選結直腸癌(例如腸癌)、胃癌或子宮內膜癌的無創診斷，預后評估，治療方案的選擇或遺傳篩查中的用途。

發明背景

微衛星是基因上含有的重復DNA短小序列或單核苷酸區域。在腫瘤細胞中，當DNA發生甲基化或基因突變致錯配修復基因缺失時,可導致微衛星重復序列錯配(微衛星突變)，導致其序列縮短或延長，從而引起微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)。根據MSI不穩定的程度，可分為微衛星高度不穩定(microsatellite instability-high,MSI-H)，微衛星低度不穩定(microsatellite instability-low,MSI-L)，和微衛星穩定(microsatellite stable，MSS)型。

大量研究表明，MSI參與惡性腫瘤的發生發展過程，與結直腸癌(例如腸癌)、胃癌、子宮內膜癌等發生密切相關。例如，約15％的結直腸癌患者存在MSI-H現象，其中典型的遺傳性非息肉病性結直腸癌(hereditary nonpolyposis colerectal cancer,HNPCC)患者90％以上存在MSI-H，表明MSI-H可作為檢測是否為HNPCC患者的重要標志物；與MSS(即微衛星穩定)的結直腸癌相比，攜帶有MSI-H的結直腸癌患者預后更好，并且二者藥物反應也不一樣，提示MSI-H可作為結直腸癌預后的獨立預測因子，因此，MSI檢測對結直腸癌患者意義重大。

2016年最新版美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive CancerNetwork，NCCN，2016Version 2)的結直腸癌治療指南第一次明確指出“有結/直腸癌病史的全部患者均應檢測MMR(錯配修復)或MSI”，因為MSI-H(即高微衛星不穩定)的II期結直腸癌預后良好(單純手術5y-OS率為80％)，且不能從5FU輔助化療中獲益(反而有害)。并且指南首次將PD-1單抗Pembrolizumab和Nivolumab推薦用于具有dMMR/MSI-H分子表型的mCRC末線治療，充分說明了晚期結直腸癌中檢測MMR及MSI的重要性。同時，由于遺傳性結直腸癌相關基因較多，在2016最新的NCCN結直腸癌遺傳風險評價指南中，建議有明顯家族史的患者和家屬采用多基因組合(panel)測序進行首次檢測。

2017年，默沙東PD-1單抗Keytruda被美國FDA批準用于治療攜帶MSI-H或錯配修復缺陷(dMMR)的實體瘤患者,再次證明了MSI-H可以作為一種獨立于腫瘤發病位置的泛癌種癌癥標志物。因此，癌癥的MSI檢測至關重要。

目前MSI檢測方法局限于組織檢測，例如國內醫院中開展的MMR基因檢測通常僅包含MLH1和MSH2，部分同時包含MSH6以及PMS2，其陽性結果與MSI檢測結果吻合率較低；僅有極少數醫院開展了通過PCR法結合毛細管電泳法的MSI狀態檢測，且多為外送檢測。該方法通常選擇5-11個單核苷酸重復位點，長度為25bp左右，PCR擴增后通過毛細管電泳測量其長度分布區間，來確定樣本的微衛星(不)穩定狀態。該方法為目前的金標準檢測方法。近來，基于二代測序的組織MSI檢測方法已經證明與PCR-MSI有極高的一致率，可以在判斷MSI狀態的同時刻畫基因組圖譜，提供癌癥診斷更豐富的信息。然而，這些方法都需要足夠的腫瘤細胞占比。由于血漿循環腫瘤DNA(ctDNA)極少，基于組織的方法無法在血漿里推行。