[發(fā)明專利]一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811146561.7
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109266612A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 顧凱強;葛遠龍;李國慶;楊奇飛;黃洪斌;周君
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇凱強醫(yī)學(xué)檢驗有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京成實知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11724
• 代理人: 朱明福

本發(fā)明公開了一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法，所述方法包含步驟：(a)將樣本通過密度梯度離心處理樣本，且樣本取自癌癥患者的體液，檢測經(jīng)處理樣本，即候選樣本，涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。該在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法，利用兩種能特異吸附的生物磁珠吸附出對端粒酶活性檢測會產(chǎn)生影響的免疫細胞，使實驗不會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，通過負向篩選保證其他細胞仍在樣本中，使得實驗不會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法。

背景技術(shù)

癌細胞是由正常細胞惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具有不可控的增殖和轉(zhuǎn)移能力。由于癌細胞具有高轉(zhuǎn)移特征，在癌癥患者尿液、血液等體液中含有脫落的癌細胞，可以作為癌癥早期篩查和預(yù)后診斷的指標。已知在超過90％的癌細胞中均可以檢測到端粒酶，而正常體細胞中是檢測不到端粒酶的。因此對新鮮體液樣本中細胞的端粒酶的檢測，可以對癌癥的早篩及預(yù)后起到參考作用。這作為一種無創(chuàng)檢查手段，在腫瘤的早期診斷中有著重要意義，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展、高敏感性方法的應(yīng)用及特異性指標的檢測，提高了微轉(zhuǎn)移檢測的陽性率，陽性者是否一定發(fā)展為轉(zhuǎn)移，需要具備腫瘤細胞有活性和有癌細胞適宜種植的場所這兩個基本條件。

患者的癌細胞表現(xiàn)出完全不同于正常細胞的生理特征。實際上，使用密度梯度離心的方法處理樣本，獲得的樣本中除了所需的細胞，還含有大量其他的免疫細胞。在部分免疫細胞中有少量端粒酶的存在，會對端粒酶活性檢測產(chǎn)生影響，從而出現(xiàn)假陽性等結(jié)果；使用流式細胞儀對樣本進行處理的話，只能捕捉到已知表面抗原的癌細胞，對未知的不能捕捉，從而會產(chǎn)生假陰性等結(jié)果。

上述的檢測癌癥疾病的特性。為此，期望上述定制篩選癌細胞的方法有效地用于癌癥相關(guān)疾病，因此已積極進行了以上研究。

本發(fā)明人做出了廣泛的努力來開發(fā)更好的用于針對癌癥的早期篩查與預(yù)后的方法，已開發(fā)出一個在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容

(一)解決的技術(shù)問題

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法，解決體液樣本中部分免疫細胞對端粒酶活性檢測的干擾問題。

(二)技術(shù)方案

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法，所述方法包含步驟：(a)將樣本通過密度梯度離心處理樣本，且樣本取自癌癥患者的體液，檢測經(jīng)處理樣本，即候選樣本；(b)取得候選樣本加入500ul的分離緩沖液，再加入經(jīng)預(yù)洗的磁珠，并放置在四維旋轉(zhuǎn)儀上進行旋轉(zhuǎn)孵育，旋轉(zhuǎn)過后再將候選樣本放置在磁力架上，取上清轉(zhuǎn)入新離心管中，通過離心設(shè)備，離心參數(shù)為1500rpm/min，水平離心5min，去掉上清液，得到標準樣本；(c)將標準樣本通過磁珠PCR技術(shù)去除殘留的蛋白質(zhì)影響，最后進行TRAP法對標準樣本進行端粒酶活性檢測，本發(fā)明還提供一種密度梯度離心方法；(i)將癌癥患者的體液樣本通過離心設(shè)備，離心參數(shù)為1500rpm/min，進行水平離心5min；(ii)將步驟(i)中離心后，所得樣本去上清，并且加入5ml的1*PBS溶液，再加入2至3ml的淋巴細胞分離液，通過離心設(shè)備，離心參數(shù)為1600rpm/min，水平離心10min；(iii)將步驟(ii)中離心后，取所得樣本的中間液面分界層液體3至4ml移至另離心管中，通過離心設(shè)備，離心參數(shù)為1500rpm/min，水平離心5min，去掉上清液，得到候選樣本。

優(yōu)選的，所述離心設(shè)備為GT10-1型離心機。

本發(fā)明還提供了一種分離緩沖液配置，其中步驟(b)中所述的分離緩沖液通過用1*PBS溶液配置，且包含0.1％BSA和2mM EDTA。

優(yōu)選的，所述磁珠的型號包括thermofisher 11153D和thermofisher 11137D。