[發明專利]一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法在審
| 申請號： | 201811146561.7 | 申請日： | 2018-09-28 |
| 公開（公告）號： | CN109266612A | 公開（公告）日： | 2019-01-25 |
| 發明（設計）人： | 顧凱強;葛遠龍;李國慶;楊奇飛;黃洪斌;周君 | 申請（專利權）人： | 江蘇凱強醫學檢驗有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/09 | 分類號： | C12N5/09 |
| 代理公司： | 北京成實知識產權代理有限公司 11724 | 代理人： | 朱明福 |
| 地址： | 226300 江蘇省南通市高*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 樣本 生物磁 負向 癌細胞 篩選 吸附 密度梯度離心 生物檢測技術 酶活性檢測 候選樣本 免疫細胞 體液 假陽性 假陰性 對端 癌癥 細胞 檢測 保證 | ||
1.一種在液體活檢中利用生物磁珠負向篩選癌細胞的方法，所述方法包含步驟：
(a)將樣本通過密度梯度離心處理樣本，且樣本取自癌癥患者的體液，檢測經處理樣本，即候選樣本，其中密度梯度離心是通過下述步驟實現的：
(i)將癌癥患者的體液樣本通過離心設備，離心參數為1500rpm/min，進行水平離心5min；
(ii)將步驟(i)中離心后，所得樣本去上清，并且加入5ml的1*PBS溶液，再加入2至3ml的淋巴細胞分離液，通過離心設備，離心參數為1600rpm/min，水平離心10min；
(iii)將步驟(ii)中離心后，取所得樣本的中間液面分界層液體3至4ml移至另離心管中，通過離心設備，離心參數為1500rpm/min，水平離心5min，去掉上清液，得到候選樣本；
(b)取得候選樣本加入500ul的分離緩沖液，再加入經預洗的磁珠，并放置在四維旋轉儀上進行旋轉孵育，旋轉過后再將候選樣本放置在磁力架上，取上清轉入新離心管中，通過離心設備，離心參數為1500rpm/min，水平離心5min，去掉上清液，得到標準樣本；
(c)將標準樣本通過磁珠PCR技術去除殘留的蛋白質影響，最后進行TRAP法對標準樣本進行端粒酶活性檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其中離心設備為GT10-1型離心機。
3.根據權利要求1所述的一種方法，其中步驟(b)中所述的分離緩沖液通過用1*PBS溶液配置，且包含0.1％BSA和2mM EDTA。
4.根據權利要求1所述的一種方法，其中步驟(b)中所述磁珠的型號包括thermofisher11153D和thermofisher 11137D。
5.根據權利要求4所述的一種方法，其中步驟(b)中預洗的磁珠是通過下述步驟實現的：
(i)按照一個樣本10ul的11153D和10ul的11137D磁珠量混合加入到1ml分離緩沖液中進行預洗；
(ii)預洗磁珠后，用磁力架吸附磁珠去除預洗液，再加入等量的20ul預洗液重懸磁珠。
6.根據權利要求1所述的一種方法，其中步驟(c)中磁珠PCR技術去除殘留的蛋白質通過下述步驟實現：
(i)結合在磁珠上的核酸延伸產物通過磁場分離，并洗脫細胞碎片；
(ii)在磁珠中加入PCR體系直接進行PCR擴增。
7.根據權利要求1所述的一種方法，其中步驟(b)中候選樣本在四維旋轉儀上進行旋轉時，溫度為4℃，并且旋轉時間為1h。
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