[發明專利]一種捕獲特定微量細胞的裝置及其制作和使用方法

有效

• 申請號: 201811146552.8
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109517722B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 張珝;陳永麗
• 申請（專利權）人: 德拜至臻醫學科技（杭州）有限公司
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

1.一種捕獲特定微量細胞的裝置，其特征在于，包括磁珠、連接核酸和含多拷貝適配體的長鏈核酸；所述連接核酸一端固定在磁珠表面，另一端以堿基互補的形式連接含多拷貝適配體的長鏈核酸；

所述連接核酸由天然或化學修飾的核苷酸組成，所述含多拷貝適配體的長鏈核酸是由多個單價核酸適配體和與連接核酸互補的間隔序列組成的單鏈核酸；

所述連接核酸的長度為10~200個核苷酸單元，所述連接核酸與含多拷貝適配體的長鏈核酸序列中部分序列互補配對；所述連接核酸是多個重復的A或者T序列，或者是其他與含多拷貝適配體的長鏈核酸序列中的部分序列互補配對的核酸序列；所述含多拷貝適配體的長鏈核酸的長度為200~300000個核苷酸單元，間隔序列為3~40個核苷酸單元的重復T或者A序列，且與連接核酸互補；

所述磁珠通過生物素-親和素或生物素-鏈霉親和素結合方式將連接核酸固定在磁珠表面。

2.根據權利要求1所述的捕獲特定微量細胞的裝置，其特征在于，所述磁珠的粒徑為0.1~25 μm，所述磁珠的表面包被生物素或者親和素或鏈霉親和素。

3.根據權利要求1所述的捕獲特定微量細胞的裝置，其特征在于，所述連接核酸的3’或者5’端修飾生物素或親和素或者鏈霉親和素。

4.根據權利要求1所述的捕獲特定微量細胞的裝置，其特征在于，所述含多拷貝適配體的長鏈核酸的合成方法采用聚合酶鏈式反應或核酸等溫擴增技術。

5.一種如權利要求1至4任一項所述的捕獲特定微量細胞的裝置的制作方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將鏈霉親和素或親和素或生物素標記的磁珠洗滌、離心，重懸于PBS中；

2）與1）相對應結合的生物素或鏈霉親和素或親和素標記的連接核酸用PBS配成母液；

3）取磁珠和連接核酸，混勻，室溫在搖床上反應1~3h;

4）將上述反應產物置于磁力架上，室溫下，磁性分離處理5~30 min，緩慢去除其中的液體，剩余的即為磁珠-連接核酸復合物；

5）將含多拷貝適配體的長鏈核酸與上述步驟4）中的復合物混合于PBS中，室溫在搖床上反應1~3 h；

6）將5）中的反應產物置于磁力架上，室溫處理5~30 min，緩慢吸取去除其中的液體，剩余的即為所述的捕獲特定微量細胞的裝置。

6.根據權利要求5所述的捕獲特定微量細胞的裝置的制作方法，其特征在于，所述步驟3）中磁珠和連接核酸的物質的量比為1:20~10¹⁰；所述步驟5）中磁珠-連接核酸復合物和含多拷貝適配體的長鏈核酸的物質的量比為1:2~10⁶。

7.一種利用權利要求1至4任一項所述的捕獲特定微量細胞的裝置進行捕獲細胞的方法，該方法為非疾病的診斷和治療目的，其特征在于，所述方法為直接法或間接法，所述直接法包含以下步驟：

1）將鏈霉親和素或親和素或生物素標記的1~25 μm磁珠洗滌、離心，重懸于PBS中；

2）與上述1）相應的生物素或鏈霉親和素或親和素標記的連接核酸用PBS配成母液；

3）取磁珠和連接核酸，混勻，室溫在搖床上反應1~3 h；所述的磁珠和連接核酸的物質的量比為1:20~10¹⁰；

4）將上述反應產物置于磁力架上，室溫處理5~30 min，緩慢吸取液體，剩余的即為磁珠-連接核酸復合物；

5）將含多拷貝適配體的長鏈核酸與上述步驟4）中的磁珠-連接核酸復合物混合于PBS中，室溫在搖床上反應1~3 h；所述磁珠-連接核酸復合物和含多拷貝適配體的長鏈核酸的物質的量比為1:2~10⁶；

6）將細胞混勻于PBS中，將步驟5）中的混合后的復合物重懸于PBS中形成溶液，4~25 °C下在搖床上反應10~60 min；

7）將上述6）得到反應物在磁力架上放置5~30 min，緩慢吸取液體，并用PBS清洗2次，此時獲得捕獲的細胞；

所述間接法包含以下步驟：

1）將鏈霉親和素或親和素或生物素標記的0.1~1 μm磁珠洗滌、離心，重懸于PBS中；

2）與1）相應的生物素或者鏈霉親和素或親和素標記的連接核酸用1×PBS配成母液；

3）取磁珠和連接核酸，混勻，室溫在搖床上反應1~3 h；所述的磁珠和連接核酸的物質的量比為1:20~10¹⁰；

4）將上述反應產物置于磁力架上，室溫處理5~30 min，緩慢吸取液體，剩余的即為磁珠-連接核酸復合物；該復合物重新懸浮于PBS緩沖液中；

5）將含多拷貝適配體的長鏈核酸與細胞混懸液混合，在4~25 °C下搖床反應10~30min，離心，去除上清，并重新懸浮于適量PBS緩沖液中，形成待分離靶細胞-長鏈核酸復合物；所述待分離靶細胞和含多拷貝適配體的長鏈核酸的個數比為1：10³~10²⁰；

6）將步驟5）中的混合液與上述步驟4）中的復合物混合，4~25 °C下在搖床上反應1~3h；所述磁珠-連接核酸復合物和細胞-含多拷貝適配體的長鏈核酸復合物的個數比為2~10⁵：1，得到反應產物置于磁力架上，室溫處理5~30 min，緩慢吸取液體，剩余的即為磁珠-細胞復合物。