[發(fā)明專利]一種亞胺類吖啶熒光探針制備及標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞中bcl-2蛋白方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811143600.8
• 申請日: 2018-09-29
• 公開（公告）號: CN109354586A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柯方;駱兵;盧梅秀;吳斌;蘇慧敏;林媚;陳艷
• 申請（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C07D401/12
• 分類號: C07D401/12;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

本發(fā)明公開一種亞胺類吖啶熒光探針制備及標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞中bcl?2蛋白方法，利用亞胺類吖啶對口腔鱗癌細(xì)胞中bcl?2蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，并與異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記進(jìn)行光穩(wěn)定性比較，本發(fā)明探針技術(shù)效果如下：1、吖啶熒光探針在熒光顯微鏡下，最大發(fā)射波長為470 nm。在熒光倒置顯微鏡下可見吖啶熒光探針對人舌癌Tca8113細(xì)胞中的bcl?2蛋白標(biāo)記明顯，表現(xiàn)為藍(lán)色；2、本發(fā)明有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)FITC標(biāo)記方法相比較為優(yōu)越。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)光材料檢測領(lǐng)域，具體涉及一種亞胺類吖啶熒光探針制備方法及利用該探針標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞中bcl-2蛋白的方法。

背景技術(shù)

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展由多因素導(dǎo)致。研究表明，細(xì)胞的凋亡在口腔癌發(fā)生和發(fā)展過程中有重要作用。Bcl-2蛋白是該領(lǐng)域研究較多的凋亡相關(guān)蛋白，bcl-2調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在口腔鱗癌中都有異常表達(dá)。長期以來，有機(jī)熒光一直被用來標(biāo)記生物大分子以研究各種蛋白質(zhì)之間的相互作用及對細(xì)胞的功能的影響。但是由于目前現(xiàn)有的熒光材料的缺點(diǎn)，例如光穩(wěn)定性差，熒光壽命短等，限制了其作為標(biāo)一記物在生物分子、細(xì)胞、體內(nèi)生物成像研究中的應(yīng)用。因此開發(fā)發(fā)光度強(qiáng)，有持久的光化學(xué)穩(wěn)定性等熒光材料使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分子、細(xì)胞及體內(nèi)的成像，尤其在腫瘤學(xué)的生物成像技術(shù)研究中，前景非常廣闊。

吖啶及其衍生物是一類由蒽中間環(huán)上的一個碳原子被氮原子取代而形成的含氮的三元環(huán)化合物，又稱氮蒽。1871年，吖啶由Carl Gr?be等人從煤焦油中提取并獲得發(fā)展。吖啶類化合物擁有特殊的結(jié)構(gòu)，且有很好的光學(xué)活性，是一種非常具有潛力的熒光探針。

本發(fā)明使用亞胺類吖啶化合物作為熒光探針獨(dú)特的光學(xué)特性觀察口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白的定位及與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）進(jìn)行比較，然后使用亞胺類吖啶吡啶探針口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白進(jìn)行免疫熒光成像研究，最后分析亞胺類吖啶吡啶探針對口腔鱗癌活細(xì)胞的影響，利用亞胺類吖啶吡啶探針對口腔鱗癌活細(xì)胞bcl-2蛋白進(jìn)行觀察。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種用于標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白的小分子熒光探針和應(yīng)用。吖啶類的熒光反應(yīng)體系較之其他的熒光化合物簡單，不需要加入催化劑，在酸或者堿的體系中，就能發(fā)出強(qiáng)烈熒光，并且具有發(fā)光效率高，背景干擾小等特點(diǎn)，是一類具有廣闊前途的熒光探針。

本發(fā)明的另一目的是提供一類用于標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白的小分子熒光探針的合成方法， 該方法具有操作方便、原料廉價、提純簡單等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種亞胺類吖啶熒光探針，其特征在于：該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)，該熒光探針能與口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白結(jié)合：

本發(fā)明所述的一種用于標(biāo)記口腔鱗癌細(xì)胞bcl-2蛋白的亞胺類吖啶熒光探針的合成方法，包括如下步驟：

(1)中間體化合物I的合成:

在裝有冷凝管和攪拌子的雙頸瓶中加入3 mmol吖啶酮，充入N₂，在N₂氣氛中加入6 mlSOCl₂，80 ℃下回流3 h，待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液邊攪拌邊緩慢滴入到冰水中，將冰，濃氨水和氯仿的混合液加入到上述液體中，分離氯仿層，用無水硫酸鎂干燥，過濾，得到淡黃色液體，用乙酸乙酯：石油醚的體積比=1：2過柱色譜純化，得到白色針狀結(jié)晶，具有強(qiáng)烈的熒光的中間體化合物I；

(2)中間體化合物II的合成：