[發明專利]一種重組腺病毒的表達載體SAd23-L

在審

• 申請號: 201811139300.2
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109797168A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 羅升學;劉博超;馬曉瑞;張攀麗
• 申請（專利權）人: 廣州佰芮慷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 廖苑濱;許青華

本發明公開了一種重組腺病毒表達載體，所述載體特征包括：以野生型腺病毒SAd23的基因組為基礎，通過分子克隆的方法，刪除E1編碼區和E3編碼區，在E1刪除區插入I?Ceu I和PI?Sce I酶切位點，同時以腺病毒人血清型Ad5的E4編碼區替換SAd23的E4編碼區，提高了在人源腎胚細胞（HEK293）中包裝重組病毒的成功率和包裝出重組病毒的滴度，獲得復制缺陷性的重組腺病毒表達載體。本發明的優勢在于：1.通過直接分子克隆的方法，構建大片段質粒，方法簡單，易操作，可以用于任何大片段載體的構建；2.通過幾次克隆連接可以構建完成腺病毒表達載體，步驟簡單；3.在細菌水平篩選陽性克隆更加容易、快捷，而且縮短了腺病毒載體構建時間。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是一種用于基因治療和疫苗載體的重組腺病毒載體；具體是本發明涉及一種重組腺病毒的表達載體SAd23-L。

背景技術

腺病毒（adenovirus, Ad）作為基因表達載體的研制起始于20世紀60年代初。腺病毒可以在不同動物體內刺激誘導出有效的T細胞和B細胞免疫應答，但是不同型別的腺病毒誘導能力是不相同。C亞群中的腺病毒誘導的針對外源基因的特異性T細胞免疫和B細胞免疫反應最強。基于腺病毒人血清型5（Ad5）和2（Ad2）型的表達載體在疫苗研究以及治療中被廣泛應用，但是由于人體內普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反應，這種預存的免疫反應包括抗腺病毒中和抗體和針對腺病毒的殺傷性T細胞，從而抑制其進入機體細胞而其所攜帶的目的基因就得不到預期水平的表達甚至是完全不表達，此外具有交叉性的針對腺病毒載體的細胞免疫CTL反應會殺死已經感染了腺病毒載體的靶細胞從而阻斷外源基因的持續表達。為了克服預存免疫反應對腺病毒載體的影響，研究者們嘗試了多種方法：（1）利用新方法轉運重組Ad5載體；（2）對Ad5載體進行基因工程改造；（3）從其它人腺病毒血清型甚至其他動物種屬中開發新的重組腺病毒載體。由于人群中一般不會含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗體，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗載體，其免疫效果顯著優于以人血清型腺病毒構建的疫苗載體。該方法具體是以源于黑猩猩型腺病毒23型，改造為復制缺陷型的腺病毒載體。

但是，之前構建的基于黑猩猩型腺病毒的表達載體，都需要在人源腎胚細胞中完成病毒的包裝，由于種屬的差異性，包裝出的重組病毒無論是滴度還是純度都達不到臨床使用的標準，跟在人源腎胚細胞包裝出的Ad5病毒載體相比有一定差距。

CN201710814259.3公開了一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因組為基礎，通過基因組直接克隆方法，刪除E1編碼區和E3編碼區，在E1刪除區插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位點，獲得復制缺陷性的重組腺病毒表達載體。但是，發明人在實踐中發現，采用這種方法構建的載體Sad23，在包裝成功病毒之后，在擴增病毒，準備純化的過程中遇到困難，病毒感染很多的HEK293細胞之后，回收細胞，凍融細胞，上清氯化銫純化的病毒總是達不到理想的病毒滴度，Sad23-eGFP病毒感染90個75T的HEK293細胞之后，純化得到的重組病毒，經過空斑形成實驗確定最終的滴度只有10⁹PFU/ml。即Sad23病毒載體在擴增病毒的過程，產生的毒量太低，然后影響其在實際的臨床中的應用，因此需要進一步改進。

發明內容

為了彌補已有腺病毒表達載體的在病毒滴度低，純化困難等方面的缺陷，本發明提供一種新的重組的腺病毒表達載體

本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案予以實現。

一種重組腺病毒表達載體，其是以野生型腺病毒SAd23的基因組為基礎，通過基因組直接克隆方法，刪除E1編碼區和E3編碼區，在E1刪除區插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位點，同時以人血清型腺病毒Ad5的E4編碼區替換SAd23的E4編碼區，獲得復制缺陷性的重組腺病毒表達載體。其中，野生型腺病毒SAd23的基因組的genebank登錄號為AY530877，人血清型腺病毒Ad5基因組的genebank登錄號為AY601635.1。