[發明專利]一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用

在審

• 申請號: 201811137547.0
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109326326A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 朱麗萍;楊松
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: G16B30/10
• 分類號: G16B30/10;G16B25/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，對云芝基因組利用antismash軟件進行產物分析以及糖苷轉移酶同源分析，篩選潛在的目的基因；利用轉錄組測序分析，進一步對目的木糖苷轉移酶基因進行定位；木糖苷轉移酶基因的克隆、表達、分離和純化；木糖苷轉移酶功能活性鑒定。本發明的有益效果是充分利用轉錄組和代謝組學體系對真菌產物進行了基因定位，表達并鑒定了一種木糖苷轉移酶，并對相關的酶學性質和應用進行了充分的研究。

技術領域

本發明屬于真菌酶學活性技術領域，涉及一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用。

背景技術

擔子菌多孔菌科能夠產生各種高藥用價值的次級代謝產物，其中糖苷化合物(glycosides)因具有豐富的結構多樣性和顯著的抗氧化、抗腫瘤、免疫等生物學活性成為近年研究熱點。申請者在研究多孔菌科真菌云芝和樹舌靈芝的共培養體系產物潛能，發現云芝能產生以木糖(xylose)為糖體的一系列新穎木糖苷衍生物，特別是鑒定到一個云芝來源的以PKS化合物苔色酸氨基衍生物作為糖苷配基的雙木糖基衍生物C18H25NO11(圖1)，具有顯著抑制酵母、新型隱球菌、革蘭氏陽性細菌的活性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，本發明的有益效果是充分利用轉錄組和代謝組學體系對真菌產物進行了基因定位，表達并鑒定了一種木糖苷轉移酶，并對相關的酶學性質和應用進行了充分的研究。

本發明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：

步驟1，對云芝基因組利用antismash軟件進行產物分析以及糖苷轉移酶同源分析，篩選潛在的目的基因；

步驟2，利用轉錄組測序分析，進一步對目的木糖苷轉移酶基因進行定位；

步驟3，木糖苷轉移酶基因的克隆、表達、分離和純化；

步驟4，木糖苷轉移酶功能活性鑒定。

進一步，步驟1：對已測序的云芝基因組，利用生物信息學軟件進行基因組掃描與預測分析，用antismash軟件進行次級代謝產物基因簇的預測分析，找到與目標產物合成相關的基因簇，接著利用糖苷轉移酶的同源序列比對相似度分析，對基因組內存在的與糖基轉移相關的候選基因。

進一步，步驟2：選取單獨液體培養的云芝菌絲球和共培養后分離的云芝菌絲球作為實驗樣本，分別進行轉錄組測序分析，分析轉錄組峰差異表達的基因，并進一步針對這些基因進行富集GO分析和KEGG代謝通路分析，進一步定位合成糖基轉移酶相關的基因。結合步驟1的預測分析，最終確定目的合成基因。

進一步，步驟3：提取云芝基因組，利用cDNA進行目的基因的PCR克隆，利用pET表達性質粒在E.coli(DE3)宿主中構建表達木糖基轉移酶的重組菌株，IPTG誘導、純化木糖基轉移酶，構建體外木糖基轉移酶檢測系統，利用LC-MS檢測產物的生成和底物消耗，測定轉移酶對不同底物(苔色酸、苯乳酸、UDP-葡萄糖等)的Km和Kcat值。

進一步，步驟4：建立木糖基轉移酶的同源建模和分子對接：通過PDB數據庫，搜索結構相近的蛋白質作為建模模板，利用同源建模軟件(Modeller)構建并優化目標蛋白整個結構模型，并對模型進行質量檢測與評估；利用Autodock將各種底物與木糖基轉移酶對接，通過ZINC數據庫獲取底物配體結構文件，選擇對接靶點和合適的對接參數，分析對接結果。

附圖說明

圖1是化合物結構圖；

圖2是云芝新穎糖苷化合物的基因簇鑒定及其苔色酸的結構域組成及生物合成分析；

圖3是單培養與共培養模式下云芝差異表達基因聚類圖；

圖4是差異基因GO分析和KEGG分析。

具體實施方式