[發明專利]一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用

在審

• 申請號: 201811137547.0
• 申請日: 2018-09-28
• 公開（公告）號: CN109326326A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 朱麗萍;楊松
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: G16B30/10
• 分類號: G16B30/10;G16B25/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，其特征在于：

步驟1，對云芝基因組利用antismash軟件進行產物分析以及糖苷轉移酶同源分析，篩選潛在的目的基因；

步驟2，利用轉錄組測序分析，進一步對目的木糖苷轉移酶基因進行定位；

步驟3，木糖苷轉移酶基因的克隆、表達、分離和純化；

步驟4，木糖苷轉移酶功能活性鑒定。

2.按照權利要求1所述一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，其特征在于：所述步驟1：對已測序的云芝基因組，利用生物信息學軟件進行基因組掃描與預測分析，用antismash軟件進行次級代謝產物基因簇的預測分析，找到與目標產物合成相關的基因簇，接著利用糖苷轉移酶的同源序列比對相似度分析，對基因組內存在的與糖基轉移相關的候選基因。

3.按照權利要求1所述一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，其特征在于：所述步驟2：選取單獨液體培養的云芝菌絲球和共培養后分離的云芝菌絲球作為實驗樣本，分別進行轉錄組測序分析，分析轉錄組峰差異表達的基因，并進一步針對這些基因進行富集GO分析和KEGG代謝通路分析，進一步定位合成糖基轉移酶相關的基因，結合步驟1的預測分析，最終確定目的合成基因。

4.按照權利要求1所述一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，其特征在于：所述步驟3：提取云芝基因組，利用cDNA進行目的基因的PCR克隆，利用pET表達性質粒在E.coli宿主中構建表達木糖基轉移酶的重組菌株，IPTG誘導、純化木糖基轉移酶，構建體外木糖基轉移酶檢測系統，利用LC-MS檢測產物的生成和底物消耗，測定轉移酶對不同底物的Km和Kcat值。

5.按照權利要求1所述一種云芝木糖苷轉移酶的分離及應用，其特征在于：所述步驟4：建立木糖基轉移酶的同源建模和分子對接：通過PDB數據庫，搜索結構相近的蛋白質作為建模模板，利用同源建模軟件構建并優化目標蛋白整個結構模型，并對模型進行質量檢測與評估；利用Autodock將各種底物與木糖基轉移酶對接，通過ZINC數據庫獲取底物配體結構文件，選擇對接靶點和合適的對接參數，分析對接結果。