[發明專利]從胎盤血管分離間充質干細胞的方法和所用消化酶組合物

有效

• 申請號: 201811130277.0
• 申請日: 2018-09-27
• 公開（公告）號: CN109234229B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 王正;肖海蓉
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N9/26;C12N9/64;C12N9/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及從胎盤血管分離間充質干細胞的方法和所用消化酶組合物。所述方法包括以下步驟：胎盤用酒精消毒；從胎盤剝離出胎盤血管；剪成碎塊，用PBS清洗，濾除殘留血污，得到胎盤血管組織；加混合酶液消化；終止消化，過濾收集組織液；離心所得細胞沉淀為原始的胎盤間充質干細胞(P0代)，用DMEM?F12基礎培養基重懸，取樣并計數有核細胞的數量和活率；所得細胞用凍存保護液凍存以便使用前再復蘇培養，或者繼續進行傳代和/或所得間充質干細胞進行細胞鑒定和/或檢測、凍存、建庫等操作。本發明方法可以有效的提高從胎盤的血管分離間充質干細胞的效率。

技術領域

本發明涉及從胎盤的血管中分離干細胞的方法，特別涉及從胎盤的血管中分離間充質干細胞的方法，更特別的是涉及一種使用本發明所述獨特配方的消化酶組合物從而從胎盤的血管分離間充質干細胞的方法。使用本發明方法可以有效的提高從胎盤的血管分離間充質干細胞的效率。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人類的間充質干細胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細胞，在體內和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、神經細胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明間充質干細胞具有免疫調節和造血支持作用，而且易于外源基因導入表達。因此間充質干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構建中的種子細胞，基因治療中重要的載體細胞，而且由于間充質干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血干細胞移植和器官移植中具有廣泛的應用前景。間充質干細胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養出間充質干細胞。

目前所報道的間充質干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經歷一個比較痛苦的手術，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每10⁵～10⁶個單個核細胞中大約只有1個，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質干細胞的數量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應用尤其是臨床應用中受到限制。起源于胚胎發育期胚外中胚層的胎盤是由間質、血管及滋養細胞組成，含有大量的間充質成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，從胎盤中分離培養出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的來源。

現有的從胎盤中分離干細胞從而建立胎盤干細胞庫的方法尚有諸多缺點，例如純度不足、和/或數量不高，進而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN101270349A(中國專利申請號200810061267.6，公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質干細胞分離和體外擴增培養方法”的發明；CN101693884A(中國專利申請號200910117522.9，公開日2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細胞的方法”的發明；CN102146359A(中國專利申請號201110005964.1，公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質干細胞及無血清擴增的方法”的發明。另外，中國專利申請號201210044648X公開了一種從胎盤中分離間充質干細胞的方法。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進一步改善的。