[發明專利]從胎盤血管分離間充質干細胞的方法和所用消化酶組合物

有效

• 申請號: 201811130277.0
• 申請日: 2018-09-27
• 公開（公告）號: CN109234229B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 王正;肖海蓉
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N9/26;C12N9/64;C12N9/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.從胎盤的血管中分離間充質干細胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)將胎盤浸泡于75%酒精消毒30秒，然后用PBS沖洗兩遍；

(2)從胎盤的臍帶根處剝離出胎盤血管，用手術鑷擠壓血管以清除血污；

(3)將血管剪碎成1~2mm³碎塊，用PBS清洗，再用300目濾網過濾去除殘留血污，得到胎盤血管組織；

(4)加混合酶液消化；該混合酶液是添加了混合酶的PBS緩沖液，混合酶由以下三者組成：0.1~0.3%膠原酶II、0.1~0.2%膠原酶IV、0.05~0.15%脫氧核糖核酸酶I，該混合酶液中還包含0.02~0.05%谷氨酸鈉和0.05~0.1%海藻酸鈉；

(5)添加血清終止消化，再用300目濾網過濾，收集組織液，PBS洗滌，合并清洗液；

(6)離心得到細胞沉淀，用PBS清洗一遍，離心，得到原始的胎盤間充質干細胞，用DMEM-F12基礎培養基重懸，取樣并計數有核細胞的數量和活率；所得細胞用凍存保護液凍存以便使用前再復蘇培養，或者所得細胞接著進行下面步驟的操作；

(7)使細胞接種至T75培養瓶，添加完全培養基培養；

(8)培養過程中每3天換液一次，直至細胞融合率達80%以上，傳代，得到P1代胎盤間充質干細胞；

以及任選的下列一個或多個步驟：

(9)針對步驟(8)所得胎盤間充質干細胞進行細胞鑒定和檢測；

(10)將步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存；

(11)建立包含以上步驟(9)細胞鑒定和檢測的信息的胎盤干細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(10)的凍存細胞進行關聯。

2.根據權利要求1的方法，其中步驟(4)中所述混合酶液中由以下三者組成： 0.2%膠原酶II、0.15%膠原酶IV、0.1%脫氧核糖核酸酶I。

3.根據權利要求1的方法，其中步驟(4)中加混合酶液消化0.5~2h。

4.根據權利要求1的方法，其中步驟(4)中加混合酶液消化1h。

5.根據權利要求1的方法，在步驟(6)中所述離心是以1000~2000rpm離心3~7min。

6.根據權利要求1的方法，在步驟(6)中所述離心是以1500rpm離心5min。

7.根據權利要求1的方法，在步驟(7)中接種密度為0.5~2x10⁵/cm²。

8.根據權利要求1的方法，在步驟(7)中接種密度為1x10⁵/cm²。

9.根據權利要求1的方法，在步驟(7)中，所述完全培養基其組成為：DMEM-F12+15% FBS+10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子。

10.根據權利要求1的方法，在步驟(7)中，所述培養是在37℃、5%CO₂培養箱中進行培養。

11.根據權利要求1的方法，所述混合酶液中還包含0.03%谷氨酸鈉和0.075%海藻酸鈉。

12.一種在從胎盤血管分離胎盤間充質干細胞的方法中使用的消化酶組合物，該消化酶組合物是含有組織消化酶的PBS緩沖液，所述消化酶由以下三者組成：0.1~0.3%膠原酶II、0.1~0.2%膠原酶IV、0.05~0.15%脫氧核糖核酸酶I；該消化酶組合物中還包含0.02~0.05%谷氨酸鈉和0.05~0.1%海藻酸鈉。

13.根據權利要求12的消化酶組合物，所述消化酶由以下三者組成：0.2%膠原酶II、0.15%膠原酶IV、0.1%脫氧核糖核酸酶I。

14.根據權利要求12的消化酶組合物，其中還包含0.03%谷氨酸鈉和0.075%海藻酸鈉。