[發明專利]一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法

在審

• 申請號: 201811128807.8
• 申請日: 2018-09-27
• 公開（公告）號: CN109298151A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 劉建梅;丁潔;張璐;張啟睿;莊益琳;樊曉東;田玉鳳
• 申請（專利權）人: 江蘇雅信昆成檢測科技有限公司
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

本發明公開了一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法。本方法具體包括卵粒獲取和預處理，活體染毒和樣本收集，樣本預處理及分子標志物EcR、Usp、E74表達量測定，孵化率終點觀測，數據統計與顯著性分析。本發明的優點在于，基于搖蚊卵活體（in vivo）染毒的激素調節通路基因測試技術耗時短、方法簡單，檢測靈敏度高于現有搖蚊內分泌干擾性測試標準方法，測試結果便于揭示受試物質影響搖蚊內分泌系統的內在機理。

技術領域

本發明屬于水生毒理學領域，具體涉及一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法。

背景技術

搖蚊(Chironomidae，non-biting midges)，屬昆蟲綱雙翅目長角亞目搖蚊科，是淡水水域中底棲動物的主要類群之一，其種類大約可占水域底棲生物總量的50-90％。搖蚊是一類全變態昆蟲，生命周期為12～65d。條件適宜的情況下行孤雌生殖，每只雌蚊單次平均產卵量約500 個。由于較短的生命周期、較高的繁殖量、易飼養、對水環境脅迫敏感等特點，搖蚊早已成為國內外實驗室廣泛使用的模式生物，用于指示農藥、化學品等有毒有害物質對底棲生物的急慢性危害。而鑒于其顯著的變態生活史特征，經合組織(OECD)已將其羽化、繁殖、性分化等生命特征作為篩查環境內分泌干擾物(EDCs)的評估終點并建立了一系列標準測試導則，包括OECD TG218、TG219和TG233。

然而目前用于EDCs識別的搖蚊慢性毒性測試均以搖蚊幼蟲為試驗材料，試驗周期長 (17～100d)，水-沉積物測試系統配制過程復雜、受試物質可能在水-沉積物界面發生復雜遷移轉化而導致接觸受試生物的生物有效態減少，受試物質難以在靜態條件下維持目標濃度。此外，羽化率、羽化時間、繁殖率、性別比等指標須在搖蚊羽化后同時測定，測試終點響應晚、工作量大，且上述測試終點均為個體或種群的終極危害響應，無法從分子水平揭示受試物質可能的內分泌干擾作用機理。上述缺陷為以搖蚊作為受試生物的環境內分泌干擾物識別增加了成本和技術難度。

搖蚊是一類全變態昆蟲，其全生命過程經過卵-幼蟲-蛹-成蟲4個階段。使用搖蚊卵作為試驗材料的優勢顯著：產卵量大，每蟲每次300顆以上，實驗室條件飼養繁育操作簡單，材料易得、成本低；源于統一卵串的卵粒遺傳信息相對對等，有效降低基因試驗的背景噪音；卵是搖蚊發育初始階段，是各器官形成和發育的關鍵階段，可能是觀測基于發育毒性的內分泌干擾終點的最佳時期。但蚊卵的特殊構造和生物特性也給試驗帶來一定技術難度：卵粒被薄膜包覆于卵串內，粘性很大，且單個卵粒小，卵粒難以物理分解，且卵孵化的一齡幼蟲形體小、活動快，以幼蟲為指標計數孵化率困難。解決上述問題是開展搖蚊卵毒性測試的前提。

蛻皮激素通路是昆蟲調節內分泌的主要途徑之一。EcR、USP是昆蟲蛻皮激素受體，起到控制生物基本發育和生理途徑的轉錄因子的作用，且只有當EcR和USP(超氣門蛋白)形成異源二聚體才能與MH(類固醇激素在血漿循環中轉運到其靶器官，并在進入細胞后發揮作用，作為該核受體的配體并改變基因轉錄)在細胞核內形成轉錄復合體從而調節蛻皮激素應答基因的轉錄水平。E74是蛻皮激素調節通路的早期響應基因，在變態中起到重要的作用，同時在卵泡發育過程中顯示出時間依賴的表達模式。目前蛻皮激素受體EcR和USP、蛻皮激素調節因子E74已經廣泛應用于外源性物質對果蠅、蜜蜂、家蠶等昆蟲的內分泌干擾性研究。然而由于不同物種基因差異性，上述研究中的昆蟲激素受體無法直接作為搖蚊敏感內分泌干擾性標志物，相關測試方法不適用于搖蚊。

發明內容

本發明的目的是克服現有搖蚊內分泌干擾毒性測試方法的缺陷，提供一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種能識別多種環境內分泌干擾物的搖蚊卵分子標志物包括蛻皮激素受體基因EcR和 Usp、早期響應基因E74。