[發明專利]一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法

在審

• 申請號: 201811128807.8
• 申請日: 2018-09-27
• 公開（公告）號: CN109298151A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 劉建梅;丁潔;張璐;張啟睿;莊益琳;樊曉東;田玉鳳
• 申請（專利權）人: 江蘇雅信昆成檢測科技有限公司
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一種能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征包括以下步驟：

步驟1，卵粒獲取和預處理；

步驟2，活體染毒和樣本收集；

步驟3，樣本預處理及分子標志物EcR、Usp、E74表達量測定；

步驟4，孵化率終點觀測；

步驟5，數據統計與顯著性分析。

2.根據權利要求1所述的能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟1包括：將搖蚊放入玻璃缸中，加入除氯自來水，并用紗網罩蓋在缸上，溫和曝氣，每周換水一次，實驗前24 h將繁育搖蚊的缸壁上的卵串清理干凈，第2天用大口徑吸管從繁育缸缸壁吸出新產出的小于24 h卵串，放入除氯自來水中備用。

3.根據權利要求1所述的能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟2包括：將卵串置于透明的玻璃纖維紙上，調整其形狀至自然伸展，對折玻璃紙將卵串輕夾在中間，用手術剪從中部快速將卵串剪成兩段，展開玻璃紙，快速將兩段卵串分別放入對照組和處理組中；所有處理組均設置對應的對照組，其中的卵均來自同一卵串，至少設置5個不同濃度處理組，每個處理組至少9個平行，其中3個平行用于24h基因測試，3個平行用于48h基因測試，剩余3個平行用于卵孵化終點觀測，在顯微鏡下觀測未孵化卵數量。

4.根據權利要求1所述的能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟3包括：用次氯酸鈉溶液沖洗掉卵串表面粘膜，并用試驗用水反復沖洗、離心并重懸，提取處理組和對照組卵中的總RNA，利用分光光度計檢測RNA的濃度和純度；將提取的搖蚊總RNA反轉錄成cDNA，根據標志物基因序列設計并合成相應的引物，對蛻皮激素受體基因EcR和Usp、早期響應基因E74表達量進行熒光定量PCR測定。

5.根據權利要求1所述的能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟4包括：卵孵化試驗中，自0h開始每隔24h分別觀測處理組和對照組中未孵化卵的數目，直至對照組中80%卵完成孵化。

6.根據權利要求1所述的能識別多種環境內分泌干擾物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟5包括：基因表達試驗中，以GAPDH、Actin β為內參，計算不同濃度處理組中分子標志物EcR、Usp、E74的表達量；以對照組中來自同一卵串的蟲卵中基因表達量為參照，計算處理組目標基因的相對表達量；卵孵化毒性試驗中，以對照組中來自同一卵串的蟲卵孵化率為參照，計算處理組卵孵化抑制率，分別以蛻皮激素信號基因相對表達量、卵孵化抑制率為毒性終點建立具有統計學意義的劑量-效應關系，最后采用統計學方法計算最大無顯著誘導或抑制效應的濃度NOEC或10%抑制濃度EC₁₀。