[發明專利]一種能識別多種環境內分泌干擾物的體外快速檢測方法

在審

• 申請號: 201811128785.5
• 申請日: 2018-09-27
• 公開（公告）號: CN109266759A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 王蕾;范德玲;周林軍;汪貞;劉濟寧;古文;石利利
• 申請（專利權）人: 環境保護部南京環境科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

本發明公開了一種能識別多種環境內分泌干擾物的體外快速檢測的方法，包括4個步驟：唾腺獲取和預處理，離體染毒和樣本收集，分子標志物EcR、Usp、E74表達量測定，數據統計與顯著性分析。本發明基于搖蚊唾腺離體（體外）染毒的激素調節通路基因測試技術，耗時短、方法簡單，檢測靈敏度不低于現有搖蚊內分泌干擾性測試標準方法，測試結果便于揭示受試物質影響搖蚊內分泌系統的內在機理。

技術領域

本發明屬于水生毒理學領域，具體涉及一種能識別多種環境內分泌干擾物的體外快速檢測方法。

背景技術

無脊椎動物具有與脊椎動物不同的內分泌系統，因其生命周期短、繁殖力強和/或變態發育毒性終點易識別等特性在環境內分泌干擾物(EDCs)識別中具有重要作用。其中搖蚊慢性毒性測試、搖蚊全生命周期測試等活體(in vivo)測試方法已被OECD確定為第四或第五級別EDCs識別方法。盡管這些活體測試方法能夠充分證明化學物質對無脊椎生物的內分泌干擾效應，但羽化率、羽化時間、繁殖率、性別比等毒性終點響應晚(10d以后)、工作量大，無法滿足大量化學物質內分泌干擾毒性的篩選需求。此外，上述測試終點均為個體或種群的終極危害響應，無法從分子水平揭示受試物質可能的內分泌干擾作用機理。

體外實驗技術測試成本低、時間短，且便于在分子水平揭示致毒作用機理，適用于大量化學物質的EDCs初級篩查，目前已有大量脊椎動物體外測試方法被OECD確定為第二或第三級別EDCs識別方法，如爪蛙胚胎甲狀腺信號系統測試、魚類繁殖篩選實驗等。EDCs無脊椎動物體外測試方法目前尚未形成。據歐盟委員會2018年對EDCs危害數據最新評估結果，化學物質對無脊椎動物內分泌干擾效應數據的缺失已影響EDCs篩查評估進程，以無脊椎動物為對象的內分泌干擾性測試方法開發已列入優先研究領域。

搖蚊(Chironomidae，non-biting midges)，屬昆蟲綱雙翅目長角亞目搖蚊科，是淡水水域中底棲動物的主要類群之一。作為試驗材料，搖蚊唾腺在多線染色體變異、細胞凋亡等方面已經具有長期的研究基礎，生物學信息豐富。但在EDCs識別方面尚無嘗試和探索。蛻皮激素作用通路是昆蟲內分泌作用的重要途徑之一。其中EcR、USP是昆蟲蛻皮激素受體，起到控制生物基本發育和生理途徑的轉錄因子的作用，且只有當EcR和USP(超氣門蛋白)形成異源二聚體才能與MH(類固醇激素在血漿循環中轉運到其靶器官，并在進入細胞后發揮作用，作為該核受體的配體并改變基因轉錄)在細胞核內形成轉錄復合體從而調節蛻皮激素下游應答基因的轉錄水平，其中E74即是蛻皮激素調節通路的早期響應基因的代表。三者的表達情況可以較好地表征蛻皮激素信號通路對外源性物質的響應情況。目前蛻皮激素受體EcR和USP、蛻皮激素調節因子E74已經廣泛應用于外源性物質對果蠅、蜜蜂、家蠶等昆蟲的內分泌干擾性研究。然而由于不同物種基因差異性，上述研究中的昆蟲激素受體無法直接作為搖蚊敏感內分泌干擾性標志物，相關測試方法不適用于搖蚊。

發明內容

本發明的目的是克服現有搖蚊內分泌干擾毒性測試方法的缺陷，提供一種能識別多種環境內分泌干擾物的體外快速檢測方法。為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種能識別多種環境內分泌干擾物的伸展搖蚊唾腺離體檢測方法包含：步驟1，唾腺獲取和預處理；步驟2，離體染毒和樣本收集；步驟3，分子標志物EcR、Usp、E74表達量測定；步驟4，數據統計與顯著性分析。具體如下：

1.唾腺獲取和預處理