[發(fā)明專利]一種能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811128785.5
• 申請(qǐng)日: 2018-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN109266759A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王蕾;范德玲;周林軍;汪貞;劉濟(jì)寧;古文;石利利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一種能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法，其特征包括以下步驟：

步驟1，唾腺獲取和預(yù)處理；

步驟2，離體染毒和樣本收集；

步驟3，分子標(biāo)志物EcR、Usp、E74表達(dá)量測(cè)定；

步驟4，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與顯著性分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟1包括：將搖蚊放入玻璃缸中，加入除氯自來水，并用紗網(wǎng)罩蓋在缸上，溫和曝氣，每周換水一次，收集新產(chǎn)卵塊，孵化后取四齡幼蟲并分離出唾腺，在實(shí)驗(yàn)開始前用昆蟲培養(yǎng)基沖洗15分鐘，從每只幼蟲中取出一對(duì)唾腺。

3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟2包括：來自同一只幼蟲的一對(duì)唾腺，一只用于處理組，另一只用于相應(yīng)的對(duì)照組，至少設(shè)置5個(gè)濃度處理組，每個(gè)處理組至少6個(gè)平行；將分離出的唾腺置入試驗(yàn)溶液中，暴露3 h，分別在1 h和3 h取3個(gè)平行測(cè)試蛻皮激素受體基因EcR和Usp以及早期響應(yīng)基因E74表達(dá)量。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟3包括：提取總RNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度；將提取的搖蚊總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)標(biāo)志物基因序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物序列并進(jìn)行熒光定量PCR。

5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能識(shí)別多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟4包括：以GAPDH、Actin β為內(nèi)參，計(jì)算處理組中分子標(biāo)志物EcR、Usp、E74的表達(dá)量；以對(duì)照組中來自同一個(gè)體的唾腺的目標(biāo)基因表達(dá)量為參照，計(jì)算處理組中EcR、Usp、E74的相對(duì)表達(dá)量，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算顯著影響分子標(biāo)志物的表達(dá)量的最低濃度NOEC或10%效應(yīng)濃度EC₁₀。