[發明專利]一種利用大腸桿菌工程菌靜息細胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法

有效

• 申請號: 201811126048.1
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109402182B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 王瑞明;孫淑慧;蘇靜;汪俊卿;楊曉慧
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

本發明涉及一種利用大腸桿菌工程菌靜息細胞制備10?羥基?2?癸烯酸的方法，步驟如下：(1)構建含有重組質粒pET?28a?ydiI的大腸桿菌工程菌；(2)取含有重組質粒pET?28a?ydiI的大腸桿菌工程菌，制備誘導細胞；(3)將誘導細胞經轉化培養基培養，制得靜息細胞，然后向培養基中加入10?羥基癸酸，制備10?羥基?2?癸烯酸；本發明首次公開了利用基因工程改造的含有硫酯酶的陽性重組大腸桿菌，經過特殊誘導處理后，可以通過靜息細胞發酵生產10?羥基?2?癸烯酸，實現了10?羥基?2?癸烯酸的大量生物合成。

技術領域

本發明涉及一種利用大腸桿菌工程菌靜息細胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法，屬于生物發酵技術領域。

背景技術

10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是一種含有羥基的單不飽和脂肪酸，分子式為C10H18O3。迄今為止，自然界中僅從蜂王漿及蜂膠中發現，因此又稱王漿酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫調節及抗氧化，抗腫瘤，降低血糖等多種重要的生理功能，具有極高的醫藥和保健價值，應用前景十分廣泛。該化合物結構如下：

鑒于10-HDA廣泛而重要的應用價值，尋找10-HDA高效方便、低成本生產方法的研究被廣泛重視。10-HDA的結構式如下：

目前10-HDA的獲得方法主要有物理提取法、化學合成法。其中物理提取法來源單一，蜂王漿中10-HDA含量僅為1.4％-2.4％，因此產量小，無法滿足市場需求。而化學合成法雖然可以滿足產業需求，但其操作步驟較冗繁，且化學試劑具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，對其大規模開發和利用具有重要的理論和應用價值。近年來微生物發酵合成法生產10-HDA已經成為研究者及該行業的新目標。

中國專利文獻CN108265041A(申請號201810230833.5)公開了一種小分子硫酯酶的表達方法及應用，具體涉及一種小分子蛋白硫酯酶在大腸桿菌中的重組表達及其在生產一種10-羥基-2-癸烯酸中間產物反式-2-癸烯酸中的應用。該發明將大腸桿菌酯酰輔酶A硫酯酶基因ydiI連接到含有sumo標簽的pET-28a質粒上，轉入大腸桿菌BL21(DE3)，利用重組大腸桿菌(含pET-28a-ydiI)，通過無細胞體系生產反式-2-癸烯酸。但利用生物發酵方法生產10-羥基-2-癸烯酸的相關技術未見報道。

靜息細胞是一種處于休眠狀態，不進行生長繁殖，但仍含有各種酶系，具有氧化和發酵能力，在適宜條件下可再恢復生長的處于特殊狀態的細胞。靜息細胞反應專一性強,可以提高底物轉化率,不易染雜菌,可以減少產物對菌體生長整個細胞通過提供一個安全的細胞室和最佳的環境條件，使其具有較高的及酶合成的抑制。靜息細胞為不能獨立發揮作用的酶的生物催化提供了可能，此外，還可以保證酶的穩定性。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用大腸桿菌工程菌靜息細胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法。

本發明的技術方案如下：

一種利用大腸桿菌工程菌靜息細胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法，步驟如下：

(1)構建含有重組質粒pET-28a-ydiI的大腸桿菌工程菌；

(2)取步驟(1)制得的含有重組質粒pET-28a-ydiI的大腸桿菌工程菌，接入含有抗生素的液體培養基中，在35～40℃振蕩篩選培養至菌液OD₆₀₀為0.8～1.2時，降溫至14～20℃適應0.5～2小時后，分別加入IPTG使培養基中IPTG濃度為0.5～0.8mM、加入癸烷使培養基中癸烷質量百分比濃度為2～5％、加入吐溫80使培養基中吐溫80的質量百分比濃度為0.2～0.5％，繼續誘導培養4～12小時，分離細胞，制得誘導細胞；