[發(fā)明專利]一種利用大腸桿菌工程菌靜息細(xì)胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811126048.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109402182B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王瑞明;孫淑慧;蘇靜;汪俊卿;楊曉慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/42
• 分類號(hào): C12P7/42;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南竹森知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一種利用大腸桿菌工程菌靜息細(xì)胞制備10-羥基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)構(gòu)建含有重組質(zhì)粒pET-28a-ydiI的大腸桿菌工程菌，步驟如下：

(i)以大腸桿菌酯酰輔酶A硫酯酶基因ydiI為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述步驟(i)中大腸桿菌酯酰輔酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表達(dá)的小分子硫酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(ii)將步驟(i)擴(kuò)增的ydiI基因片段和含有sumo標(biāo)簽的質(zhì)粒pET-28a用BamH I和Xho I分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接酶連接得含有sumo標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-28a-ydiI；

(iii)將步驟(ii)的重組質(zhì)粒pET-28a-ydiI轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21DE(3)，篩選陽(yáng)性重組大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)得融合型硫酯酶；

(2)取步驟(1)制得的含有重組質(zhì)粒pET-28a-ydiI的大腸桿菌工程菌，接入含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，在35～40℃振蕩篩選培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.8～1.2時(shí)，降溫至14～20℃適應(yīng)0.5～2小時(shí)后，分別加入IPTG使培養(yǎng)基中IPTG濃度為0.5～0.8mM、加入癸烷使培養(yǎng)基中癸烷質(zhì)量百分比濃度為2～5％、加入吐溫80使培養(yǎng)基中吐溫80的質(zhì)量百分比濃度為0.2～0.5％，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4～12小時(shí)，分離細(xì)胞，制得誘導(dǎo)細(xì)胞；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為降溫至16℃適應(yīng)1小時(shí)后，分別加入IPTG使培養(yǎng)基中IPTG濃度為0.64mM、加入癸烷使培養(yǎng)基中癸烷質(zhì)量百分比濃度為3％、加入吐溫80使培養(yǎng)基中吐溫80的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時(shí)，制得誘導(dǎo)細(xì)胞；

(3)將步驟(2)制得的誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng)，制得靜息細(xì)胞，然后向培養(yǎng)基中加入10-羥基癸酸至濃度為4～10g/L，在25～35℃條件下，制得10-羥基-2-癸烯酸；

所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組份如下，均為質(zhì)量百分比：

甘油0.8～1.2％,葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量為pH7.4的濃度100mM的磷酸鉀緩沖液。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中PCR擴(kuò)增體系為：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL Hifi酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL，共25μL。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(iii)中篩選陽(yáng)性菌株的方法為：采用菌落PCR鑒定和蛋白表達(dá)及可溶性鑒定，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌株再進(jìn)行測(cè)序鑒定。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，液體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，抗生素為卡那霉素，卡那霉素濃度為50μg/mL。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，分離細(xì)胞為在5000rpm條件下離心15min,收集沉淀，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.85％鹽水洗滌沉淀。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件為在25～35℃條件下培養(yǎng)20小時(shí)。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組份如下，均為質(zhì)量百分比：

甘油1％,葡萄糖0.4％,抗生素50μg/mL，余量為pH7.4的濃度100mM的磷酸鉀緩沖液。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，10-羥基癸酸在培養(yǎng)基中的濃度為8g/L。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，10-羥基癸酸溶解于二甲基亞砜。