[發明專利]一種轉移因子膠囊中多肽的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201811125550.0
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109239219A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 蔡慧俠
• 申請（專利權）人: 金花企業(集團)股份有限公司西安金花制藥廠
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 徐文權

本發明一種轉移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，由“HPLC?氨基酸差值”法測定，用建立的衍生化?HPLC法分別測定轉移因子膠囊中總氨基酸含量以及游離氨基酸含量，以兩者差值代表樣品中多肽含量。采用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生化法對氨基酸進行柱前衍生；檢測色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱；以甲醇?乙腈?水(20:60:20)為流動相A，以0.1mol/L醋酸鈉緩沖溶液(用冰醋酸調節pH值為6.3)為流動相B進行梯度洗脫。采用上述色譜條件分別測定轉移因子膠囊中總氨基酸含量及游離氨基酸含量，以兩者差值代表樣品中多肽含量；經系統的驗證研究該檢測方法無其他物質干擾、專屬性強、準確可靠，能有效地對轉移因子膠囊中的多肽含量檢測與監控。

技術領域

本發明屬于多組分生化藥質量分析研究技術領域，具體涉及一種轉移因子膠囊中多肽的定量檢測方法。

背景技術

轉移因子的主要成分為健康豬或牛脾臟中提取的多肽、氨基酸和核苷酸等，是一種天然雙向免疫調節劑，是目前治療免疫功能低下、缺陷等相關疾病的理想藥物。小分子肽類物質是轉移因子的功能標示物，并作為其主要功效成分，準確測定轉移因子中的多肽含量對于優化轉移因子生產工藝及控制產品質量具有重要的意義。

現有技術采用Follin-酚法(Lowry)對轉移因子膠囊中多肽含量進行測定，但該方法產生干擾的物質較多，如還原物質、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類及甘油等均有干擾作用。且有文獻報道，采用Follin-酚法(Lowry)測定轉移因子膠囊中多肽含量，賦性劑甘露醇及其中游離氨基酸均會干擾檢測結果，導致檢測結果不準確，重現性差。

發明內容

為了克服上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種轉移因子口服液中核苷酸類物質的定量檢測方法，該方法具有準確性高、重現性好、操作簡便的優勢。

本發明是通過以下技術方案來實現：

本發明公開了一種轉移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，包括以下步驟：

1)制備轉移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液

精密稱取轉移因子膠囊內容物1.0g，加入6～10mL濃度為6mol/L的鹽酸溶液進行微波水解，然后用6～10mL濃度為6mol/L的氫氧化鈉溶液中和，再用0.1mol/L鹽酸溶液定容至50mL，制得總氨基酸測定衍生用供試品溶液；將該總氨基酸測定衍生用供試品溶液采用異硫氰酸苯酯乙腈溶液進行衍生處理，制得轉移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液；

2)制備轉移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液

精密稱取轉移因子膠囊內容物約1.0g，置25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液適量，振蕩2min使轉移因子溶解后，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為游離氨基酸測定衍生用供試品溶液；將該游離氨基酸測定衍生用供試品溶液采用異硫氰酸苯酯乙腈溶液進行衍生處理，制得轉移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液；

3)構建標準曲線方程

精密稱取各對照品氨基酸制成貯備液，然后將貯備液制成構建標準曲線所需的對照品系列溶液，再對得到對照品系列溶液進行衍生處理，然后利用高效液相色譜法對衍生后的對照品系列溶液進行檢測獲得色譜圖，以各氨基酸對照品濃度對各氨基酸峰面積按最小二乘法進行線性回歸，求出標準曲線方程及線性相關系數；

4)測定樣品構建色譜圖

分別精密量取步驟1)制得的轉移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液和步驟2)制得的轉移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液，利用高效液相色譜法在與步驟3)相同的色譜檢測條件下獲得色譜圖，提取轉移因子膠囊中各氨基酸對應的色譜峰面積；

5)計算轉移因子膠囊中多肽含量