[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811125550.0
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109239219A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡慧俠
• 申請（專利權(quán)）人: 金花企業(yè)(集團)股份有限公司西安金花制藥廠
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 徐文權(quán)

1.一種轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)制備轉(zhuǎn)移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液

精密稱取轉(zhuǎn)移因子膠囊內(nèi)容物1.0g，加入6～10mL濃度為6mol/L的鹽酸溶液進行微波水解，然后用6～10mL濃度為6mol/L的氫氧化鈉溶液中和，再用0.1mol/L鹽酸溶液定容至50mL，制得總氨基酸測定衍生用供試品溶液；將該總氨基酸測定衍生用供試品溶液采用異硫氰酸苯酯乙腈溶液進行衍生處理，制得轉(zhuǎn)移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液；

2)制備轉(zhuǎn)移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液

精密稱取轉(zhuǎn)移因子膠囊內(nèi)容物約1.0g，置25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液適量，振蕩2min使轉(zhuǎn)移因子溶解后，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為游離氨基酸測定衍生用供試品溶液；將該游離氨基酸測定衍生用供試品溶液采用異硫氰酸苯酯乙腈溶液進行衍生處理，制得轉(zhuǎn)移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液；

3)構(gòu)建標準曲線方程

精密稱取各對照品氨基酸制成貯備液，然后將貯備液制成構(gòu)建標準曲線所需的對照品系列溶液，再對得到對照品系列溶液進行衍生處理，然后利用高效液相色譜法對衍生后的對照品系列溶液進行檢測獲得色譜圖，以各氨基酸對照品濃度對各氨基酸峰面積按最小二乘法進行線性回歸，求出標準曲線方程及線性相關(guān)系數(shù)；

4)測定樣品構(gòu)建色譜圖

分別精密量取步驟1)制得的轉(zhuǎn)移因子膠囊中總氨基酸含量測定供試品溶液和步驟2)制得的轉(zhuǎn)移因子膠囊中游離氨基酸供試品溶液，利用高效液相色譜法在與步驟3)相同的色譜檢測條件下獲得色譜圖，提取轉(zhuǎn)移因子膠囊中各氨基酸對應(yīng)的色譜峰面積；

5)計算轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽含量

根據(jù)步驟3)獲得的標準曲線方程和步驟4)獲得的色譜峰的面積，從各氨基酸回歸方程中求出游離氨基酸及總氨基酸的含量；用總氨基酸項下測得的各氨基酸含量分別減去游離氨基酸項下測得的各氨基酸含量，并將各計算結(jié)果相加，得到轉(zhuǎn)移因子膠囊中的多肽含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，所述對照品氨基酸包括18種，分別為門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及鹽酸賴氨酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，步驟3)中，高效液相的色譜檢測條件為：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱；

以流動相A和流動相B進行梯度洗脫，流動相A為甲醇、乙腈和水按20:60:20的體積比配成的混合溶液；流動相B為0.1mol/L的醋酸鈉緩沖溶液；

檢測過程中：波長為210～320nm，進樣量為1～50μL，流速為0.5～2mL/min，柱溫為20～50℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，十八烷基鍵合硅膠色譜柱的填料粒度為5～10μm，內(nèi)徑為2～5mm，長度為10～30cm。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，梯度洗脫時，流動相A與流動相B的變化比例如下：

0min，流動相A：3％、流動相B：97％；

16min，流動相A：12％、流動相B：88％；

19min，流動相A：13％、流動相B：87％；

30min，流動相A：26％、流動相B：74％；

40min，流動相A：42％、流動相B：58％；

50min，流動相A：50％、流動相B：50％；

50.1min，流動相A：100％、流動相B：0；

55min，流動相A：100％、流動相B：0；

55.1min，流動相A：3％、流動相B：97％；

65min，流動相A：3％、流動相B：97％。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的定量檢測方法，其特征在于，用冰醋酸調(diào)節(jié)流動相B的pH值為6.0～6.5。