[發明專利]一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法

有效

• 申請號: 201811121430.3
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109207567B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 周楠迪;蔡蓉鳳;尹凡;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/14;C12Q1/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法，屬于分析化學及食品安全和發酵分析技術領域。本發明首先構建靶標識別體系，通過金黃色葡萄球菌與適配體之間的高度親和力，可從雙鏈中競爭釋放cDNA；然后以cDNA為模板，在溶液中加入觸發引物序列，擴增出大量具有特定序列的單鏈DNA；加入特定發夾結構后，單鏈DNA與發夾結構在溶液中自組裝形成特定的六邊形結構；最后加入熒光染料，染料與DNA雙鏈特異性結合，釋放熒光信號。利用熒光信號與金黃色葡萄球菌數量的線性關系來計算出樣品中的金黃色葡萄球菌含量。本發明通過熒光共振能量轉移原理，將熒光信號與金黃色葡萄球菌數量關聯，實現了對牛奶等食物樣品中金黃色葡萄球菌含量的直接測定。所建立的檢測方法具有檢測周期短，靈敏度高，成本低，特異性強等特點。

技術領域

本發明涉及一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法，可以對食品和發酵樣品中金黃色葡萄球菌含量進行高靈敏的測定，屬于分析化學及食品安全和發酵分析技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一種常見的人類病原體，多見于生牛乳和生肉中，可產生多種內毒素，引起各種感染和食源性疾病，例如敗血癥，感染性心內膜炎（IE），以及骨關節炎，皮膚和軟組織，胸膜肺等，嚴重威脅人類健康，人群中大約有30%的金黃色葡萄球菌攜帶者。同時金黃色葡萄球菌也常是發酵過程中的污染菌。因此研發對金黃色葡萄球菌的高靈敏、準確的檢測方法，對于食品安全監測和發酵分析、臨床預防及治療金黃色葡萄球菌引起的多種感染具有重要的意義。

目前，檢測金黃色葡萄球菌的方法包括傳統培養，生化檢測（如顯色培養基），免疫學方法（如酶聯免疫檢測法），分子生物學方法（如多重PCR技術）等。其中，傳統培養和生化檢測方法檢測時間長，容易受到雜菌菌落形態和數量以及變種金黃色葡萄球菌的影響，出現假陰性結果；免疫學方法試驗周期長，步驟繁瑣，各種非相關抗原易引起交叉反應，食物加熱過程中產生的腸毒素蛋白凝集等會造成檢測結果的假陽性或假陰性；分子生物學方法同樣容易受到樣品成分等因素的影響。這些常用的檢測金黃色葡萄球菌的方法或需要長時間的處理、熟練的工作人員和昂貴的實驗室設備，或具有不穩定、靈敏度低、準確性差等缺點。因此建立靈敏高效的金黃色葡萄球菌檢測方法，對于食品安全監控和發酵過程監控等均具有重要的意義。

近年來，隨著組合化學和生物傳感技術的發展，多種基于適配體的生物傳感器被用來檢測病原微生物。這些生物傳感器由檢測元件和識別元件構成，通過信號轉換來檢測目標物質如電化學傳感器，熒光傳感器，比色傳感器等。適配體通過SELEX篩選技術獲得，是對特定靶標具有高親和力和特異性的DNA或RNA分子。與抗體相比，適配體更易合成和儲存，從而拓寬了它們的應用。更重要的是，許多基于核酸分子的信號放大方法進一步拓寬了適配體傳感器的檢測范圍，如滾環擴增技術（RCA）、鏈置換擴增技術（SDA）和雜交鏈式反應（HCR）等，這些技術在DNA／RNA體外定性檢測中得到了越來越廣泛的應用。生物傳感器具有檢測快速，特異性高，靈敏度強，可重復使用等特點，其應用范圍也日漸廣泛。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，建立一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌進行高靈敏、高特異性、準確的測定方法。