[發明專利]一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法

有效

• 申請號: 201811121430.3
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109207567B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 周楠迪;蔡蓉鳳;尹凡;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/14;C12Q1/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法，其特征在于：所述測定方法用于非疾病診斷和治療目的，步驟如下：首先構建靶標識別體系，由固定于磁珠上的金黃色葡萄球菌適配體和與之部分互補的序列cDNA形成雙鏈結構，通過金黃色葡萄球菌與適配體之間的高度親和力，從雙鏈中競爭釋放cDNA；然后以cDNA為模板，在溶液中加入觸發引物序列，采用具有特殊切割位點的Nb.bpu10I限制性內切酶和具有強鏈置換效應的Bsm DNA聚合酶進行偶聯反應，擴增出大量具有特定序列的單鏈DNA；加入特定發夾結構后，單鏈DNA與發夾結構在溶液中自組裝形成特定的六邊形結構；最后加入SYBR Green I熒光染料，染料與DNA雙鏈特異性結合，釋放熒光信號；利用熒光信號與金黃色葡萄球菌數量的線性關系來計算出樣品中的金黃色葡萄球菌含量；

所述金黃色葡萄球菌適配體序列如SEQ ID NO.1：

biotin-(CH₂)₆-CACACCGCAG CAGTGGGAAC GTTTCAGCCA TGCAAGCATC ACGCCCGT；

互補的序列如SEQ ID NO.2：

TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGAGCACGGGCGT GATGCTTGCA；

觸發引物序列如SEQ ID NO.3：TGCAAGCATC；

發夾結構如SEQ ID NO.4：(Hp) CGACTAATGC CTGAGTCG。

2.根據權利要求1所述基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）靶標識別體系：

a、適配體與cDNA雙鏈結構的形成：將適配體序列5'端標記上生物素，并設計與適配體部分互補的cDNA序列；將0.25μmol·L^-1 cDNA與0.25μmol·L^-1適配體加入0.1mol·L^-1PBS、pH 7.4體系中混勻，95℃變性5min后緩慢冷卻至37℃，孵育120min，使適配體與cDNA通過堿基互補配對原則形成雙鏈結構；

其中適配體序列如SEQ ID NO.1所示；與適配體部分互補的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；

b、磁珠清洗與修飾：將鏈霉親和素修飾的磁珠懸液用混勻器混勻，取100μL磁珠懸液，使用1mL PBS緩沖液清洗磁珠3次后磁性分離去除PBS緩沖液，加入100μL步驟a所得的混合液，置于37℃搖床，220r·min^-1 孵育45min，將雙鏈通過鏈霉親和素和生物素間的親和力將雙鏈固定至磁珠表面；

c、金黃色葡萄球菌的競爭結合和分離：將含有金黃色葡萄球菌的樣品在3000r·min^-1離心5min，使用PBS緩沖液清洗沉淀3次；步驟b所得的磁珠懸液用1mL PBS緩沖液清洗磁珠3次，最后重懸于100 μL含有金黃色葡萄球菌的PBS緩沖液，混勻，在37℃搖床中，220 r·min^-1孵育45 min；使用磁珠分離系統將磁珠移除體系，保留含有游離cDNA的上清液；

（2）鏈置換擴增體系

d、cDNA與觸發引物形成雙鏈：將0.0125μmol·L^-1觸發引物在95℃高溫變性后加入步驟c上清液中緩慢冷卻至37℃，孵育120min，使觸發引物與上清液中cDNA通過堿基互補配對；

觸發引物如SEQ ID NO.3所示；

e、鏈置換剪切的擴增反應：往3μL步驟d溶液中加入7.5U Nb.bpu10I切刻內切酶，3UBsm DNA聚合酶以及250 μmol·L^-1游離的脫氧核糖核苷三磷酸，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，10 mmol·L^-1 MgCl₂，100 mmol·L^-1 KCl，0.1 mg·mL^-1 BSA，混勻后在37℃孵育100min，獲得大量擴增的單鏈DNA；

（3）DNA自組裝：0.715μmol·L^-1發夾結構經95℃變性5min后加入步驟（2）完成鏈置換擴增的反應溶液，緩慢冷卻至37℃孵育120min；

發夾結構如SEQ ID NO.4所示；

（4）熒光信號檢測和標準曲線繪制：將SYBR Green I熒光染料稀釋10000倍，取30μL加入步驟（3）溶液中，染色120min，加入96孔酶標板，使用多功能酶標儀讀取空白以及含有金黃色葡萄球菌溶液的熒光信號變化，采用的激發波長為497 nm，測定發射波長為520 nm的熒光信號；通過搖瓶培養金黃色葡萄球菌溶液，逐倍稀釋，根據傳感器熒光值與金黃色葡萄球菌的濃度之間的關系，繪制出相應的線性關系曲線；

（5）實際樣品檢測：將含有金黃色葡萄球菌的樣品以步驟（1）~（4）所述操作，測定出相應的熒光值，從標準曲線中計算出相應的菌濃度。

3.根據權利要求2所述基于適配體和鏈置換擴增反應對金黃色葡萄球菌的測定方法，其特征在于：步驟（4）所述不同濃度的金黃色葡萄球菌溶液具體為7~7×10⁷ CFU/mL。