[發明專利]一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法

在審

• 申請號: 201811119210.7
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109182190A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 陳美霞;劉偉;彭成彬;柯棟賢;甘鵬
• 申請（專利權）人: 寧德師范學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00
• 代理公司: 北京權智天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11638
• 代理人: 李海燕

本發明公開了一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，涉及微生物技術領域，包括以下步驟：A：采集、B：分離、C：篩選、D：復篩、E：統計、F：制備以及G：注射，本發明根據放線菌的抑菌特性，制成能夠注入植物體內的抑菌溶液，顯著提升了植物炭疽菌拮抗作用，較目前病害防治所用的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無污染和不易產生抗藥性的特征。本發明制成的抑菌溶液，能夠對多種病原菌進行抑制，在被開發為生防菌制劑用于對植物病害的生物防治上，具有良好的市場應用前景。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法。

背景技術

植物內生菌是一類新的生防微生物資源，它是一種能在植物組織中定殖與運轉，并對植物無害甚至有益的微生物。由于它在植物體內有穩定的生存空間，且能產生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。內生菌分布于宿主植物組織內部，比暴露于外部環境的附生菌具有更穩定的生存環境，更易于發揮作用。加之，植物內生放線菌具有一定的宿主專一性，除從其宿主植物吸取養料和對侵染宿主植物的其它生物起作用外，對宿主植物本身及其它生物幾乎沒有影響，而且內生放線菌可以通過人工接種被導入不同的植物并可以通過植物種子進行遺傳。因此植物內生菌具有作為生物農藥開發的優良特性。

目前，對農作物病害的防治主要以化學防治為主，眾所周知，化學農藥的長期大量使用往往會導致環境污染、農藥殘留及病原菌的抗藥性等諸多問題難以解決。利用植物內生菌產生的抗菌活性物質進行植物病害的生物防治，則具有高效、低毒、低殘留、無污染、不易產生抗藥性和原料易得等優點。

因此，發明一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法來解決上述問題很有必要。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，解決了現有的問題。

(二)技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，包括以下步驟：

A：采集：取一定量的太子參葉斑病病葉和茶炭疽病病葉，以及一定量從太子參及茶葉主產區采集的土壤；

B：分離：首先從太子參葉斑病病葉和茶炭疽病病葉分離出炭疽病原菌，然后從太子參及茶葉主產區采集的土壤樣品中分離出多株細菌；

C：篩選：從多株細菌中篩選出多株具有拮抗炭疽病原菌的細菌菌株，然后通過平板劃線法在培養基中將菌株純化，對純化后的細菌菌株進行復篩，并在同一個培養皿中做3-5次重復，得到復篩后的細菌菌株；

D：復篩：通過擴增細菌的16-SrDNA序列，將測序回來的序列經NCBI同源比對后，構建系統進化樹，然后將細菌經過革蘭氏染色和芽孢染色，再通過全自動微生物分析系統對多種細菌進行生理生化指標測定，將其分為不同的種屬，然后通過壓片鏡檢法來篩選出放線菌；

E：統計：將含有炭疽病原菌菌落分別放入不同的培養基中(含不同種類的放線菌菌株)，培養4-6小時后，統計多種細菌菌株對炭疽病原菌的菌絲生長抑制率，得到拮抗效果最好的放線菌菌株，將其命名為菌株A 1103；

F：制備：首先將菌株A 1103放入培養基中活化，時間為2-4天，然后將活化后的菌株A 1103接種到高氏一號液體發酵培養基，取發酵液經由無菌濾紙抽濾，分別獲得上清液和菌絲體，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌絲體用60-80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡時間為8-12小時，然后用超聲波破碎提取2-4次，合并提取液，將提取液減壓濃縮至無丙酮后，得到菌株A 1103的粗提取液，

G：注射：將所得粗提物以無菌水稀釋配制成溶液，注入植物的體內。