[發明專利]一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法

在審

• 申請號: 201811119210.7
• 申請日: 2018-09-25
• 公開（公告）號: CN109182190A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 陳美霞;劉偉;彭成彬;柯棟賢;甘鵬
• 申請（專利權）人: 寧德師范學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00
• 代理公司: 北京權智天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11638
• 代理人: 李海燕

1.一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A：采集：取一定量的太子參葉斑病病葉和茶炭疽病病葉，以及一定量從太子參及茶葉主產區采集的土壤；

B：分離：首先從太子參葉斑病病葉和茶炭疽病病葉分離出炭疽病原菌，然后從太子參及茶葉主產區采集的土壤樣品中分離出多株細菌；

C：篩選：從多株細菌中篩選出多株具有拮抗炭疽病原菌的細菌菌株，然后通過平板劃線法在培養基中將菌株純化，對純化后的細菌菌株進行復篩，并在同一個培養皿中做3-5次重復，得到復篩后的細菌菌株；

D：復篩：通過擴增細菌的16-SrDNA序列，將測序回來的序列經NCBI同源比對后，構建系統進化樹，然后將細菌經過革蘭氏染色和芽孢染色，再通過全自動微生物分析系統對多種細菌進行生理生化指標測定，將其分為不同的種屬，然后通過壓片鏡檢法來篩選出放線菌；

E：統計：將含有炭疽病原菌菌落分別放入不同的培養基中(含不同種類的放線菌菌株)，培養4-6小時后，統計多種細菌菌株對炭疽病原菌的菌絲生長抑制率，得到拮抗效果最好的放線菌菌株，將其命名為菌株A 1103；

F：制備：首先將菌株A 1103放入培養基中活化，時間為2-4天，然后將活化后的菌株A1103接種到高氏一號液體發酵培養基，取發酵液經由無菌濾紙抽濾，分別獲得上清液和菌絲體，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌絲體用60-80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡時間為8-12小時，然后用超聲波破碎提取2-4次，合并提取液，將提取液減壓濃縮至無丙酮后，得到菌株A 1103的粗提取液，

G：注射：將所得粗提物以無菌水稀釋配制成溶液，注入植物的體內。

2.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟B中炭疽病原菌和細菌的分離方法均為土壤稀釋分離法。

3.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟C中篩選的方法為平板對峙法。

4.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟C中的培養基為高氏合成1號固體培養基，不含瓊脂。

5.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟C中的培養時間為6-8天，培養溫度為26-30℃。

6.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟D中全自動微生物分析系統的型號為VITEK 2 COMPACT型全自動微生物鑒定系統。

7.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟E中的培養基為加熱熔化的液體PDA培養基，培養條件為25-27℃。

8.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟E中采用十字交叉測量菌落直徑，計算菌落直徑平均值和菌絲生長抑制率，菌絲生長抑制率計算公式如下：

菌絲生長抑制率(％)＝[1-(處理菌落直徑-菌餅直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

9.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟F中的培養基為PDA斜面培養基，培養條件為28-30℃恒溫培養箱。

10.根據權利要求1所述的一種利用放線菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步驟G中溶液的濃度為200-600mg/L。