[發明專利]抑制雞Sirt1基因表達的microRNA及其重組過表質粒以及LMH細胞系

有效

• 申請號: 201811118711.3
• 申請日: 2018-09-26
• 公開（公告）號: CN109161545B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 郁建鋒;顧志良;王中亮;陳遲遲;張燕萍;邵芳;徐璐;胡悅
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;A61K31/7105;A61P1/16;A61P3/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 楊曉莉

本發明公開了一種抑制雞Sirt1基因表達的microRNA，并公開了其重組過表質粒和具體應用，以及利用過表達miRNAs構建穩定低表達Sirt1基因的LMH細胞系。相對于現有技術，本發明以人工設計的miRNA對目的基因進行干擾，并通過簡單的PCR技術直接快速的構建該miRNA的過表達載體，本發明所提供的pLNCX?pmirG為miRNA進行過表達的一個很好的載體，并能依次進行逆轉錄病毒的包裝，結合G418加壓篩選和綠色熒光蛋白檢測方法可以快速獲得穩定過表達miRNA的細胞系，不僅可以為研究揭示Sirt1基因影響肝臟對營養狀態的應答機制，也為研究人類、動物肝臟在能量代謝中的功能提供一個獨特的肝細胞亞克隆系模型。

技術領域

本發明涉及細胞工程，特別涉及抑制雞Sirt1基因表達的microRNA及其重組過表質粒以及LMH細胞系。

背景技術

SIRT1作為依賴NAD⁺的去乙酰化酶，細胞代謝狀態(能量狀態)因子NAD⁺使SIRT1成為聯系能量代謝和基因轉錄的一個重要分子，SIRT1通過NAD⁺連接著代謝水平和核內基因轉錄的網路調控，以及機體對營養、激素和環境刺激作出的應答。肝臟是動物營養物質和能量代謝的重要場所，負責糖原合成、糖異生、脂肪酸與膽固醇的合成以及脂蛋白的生成和分泌等，并能對營養狀態和激素信號作出響應，調節機體內的物質與能量平衡，尤其在糖脂類代謝方面發揮著重要的作用。當機體攝入過多的能量物質時，肝臟能將這些過量的能量物質轉化為脂肪，并轉運到脂肪組織貯存起來。長期攝入過多的能量最終會導致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相關的代謝性疾病。在家禽生產中，脂肪沉積過多不僅影響動物的健康，還會引起飼料利用率和產蛋率下降等問題。沉積的脂肪除來自飼料中的少量脂肪外，主要來自肝臟重新合成的脂肪。因此，研究肝臟的脂肪代謝及其調控機制對于控制家禽的脂肪沉積極為重要。本發明利用過表達miRNAs構建穩定低表達Sirt1基因的LMH細胞系，不僅可以為研究揭示Sirt1基因影響肝臟對營養狀態的應答機制，也為研究人類、動物肝臟在能量代謝中的功能提供一個獨特的肝細胞亞克隆系模型。

發明內容

發明目的：針對現有技術存在的技術空缺，本申請提供了抑制雞Sirt1基因表達的microRNA及其重組過表質粒以及LMH細胞系，并提供了相應的構建方法和應用。

技術方案：本發明所述的一種抑制雞Sirt1基因表達的microRNA，命名為gSmiR30，其序列如SEQ ID NO:1所示。

本發明所述microRNA通過克隆雞Sirt1基因的3′UTR序，然后選取堿基序列中的以下位點作為靶點：“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”，設計得到；所述雞Sirt1基因的3′UTR序如SEQID NO:2所示。

本發明所述的一種抑制雞Sirt1基因表達的microRNA，命名為gSmiR70，其序列如SEQ ID NO:3所示；所述gSmiR70通過克隆雞Sirt1基因的3′UTR序，然后選取堿基序列中的“TCTGGATTTAGAGCAAGGAAA”位點作為靶點設計得到；所述雞Sirt1基因的3′UTR序如SEQ IDNO:2所示。

本發明所述的一種抑制雞Sirt1基因表達的microRNA，命名為gSmiR91，其序列如SEQ ID NO:4所示；所述gSmiR91通過克隆雞Sirt1基因的3′UTR序，然后選取堿基序列中的“CCATAAGGATGTGGTGTTTAT”位點作為靶點設計得到；所述雞Sirt1基因的3′UTR序如SEQ IDNO:2所示。